拟南芥热激蛋白的 Westren Blotting试验设计书.docVIP

拟南芥At-HsfA1a过量表达转基因植株与非转基因植株的At-HsfA1a和HSP70表达量分析 (1) 转基因和非转基因植株的生长： 将转基因和非转基因的种子消毒后（无菌水浸泡半小时；1%升汞3min； 70%乙醇1min；无菌水洗三次。）分别播种于含PPT（10mg/l）和不含PPT 的1/2 MS盐培养基中。15天后，将小苗移入土中进行栽培。 (2) 小苗逆境处理（取生长状态较为健康的叶片1－3张，约80-100mg左右）： 加热处理：将叶片置于SIB缓冲液中，39℃，30min 酸处理：将叶片置于用琥珀酸调的pH值最终为3.5的SIB中，20min 碱处理：将叶片置于用Tris碱调过的pH最终为8.0的SIB中，20min 过氧化氢处理：将叶片置于5mM的过氧化氢中，45min 以上处理除加热外其余均在抽真空的情况下进行 (3) 叶片总蛋白提取： 吸去逆境处理液，同时加入PBS buffer清洗；用滤纸吸干叶片（0. 1g）表面缓冲液，加入液氮研磨；加入50ul lysis buffer +0.5ul DTT（使用的是凯基Caspase-3分光光度法检测试剂盒中配套的蛋白质提取缓冲液lysis buffer 和DTT缓冲液），冰上裂解20－60min，期间振荡3－4次，每次10秒；4℃ 10000rpm,1min,离心两次，去掉沉淀，取上清。 (4) 蛋白质浓度测定： 取5ul crude extract（粗提物）+ 95 bradford, OD595下测定光吸收值，根据标准曲线测定蛋白质粗提物的浓度。 考马斯亮兰法 具体操作步骤:（一）实验原理 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 （二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 （2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支 （三）操作方法 1. 标准方法 （1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。 （2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，