第3章分子克隆载体1(免费阅读).pptVIP

第三章 分子克隆载体 载体 将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具 特点： 在宿主细胞内能够自主复制 具备合适的酶切位点 有一定的选择标记 较高的拷贝数 第一节 质粒载体 一、质粒载体的基本特征 什么是质粒 染色体外的遗传因子，能进行自我复制，多为超螺旋双链环状DNA，少数线状 大小1~200kb 多种特殊功能基因 特征 1. 质粒的复制 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。 在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和 θ 复制。 在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。 2. 质粒的拷贝数 质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。 严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个； 松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。 ?pUC 系列质粒的复制单位来自质粒 pMB1 ，但其拷贝数较高。 pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶 Ⅰ ，DNA 聚合酶 Ⅲ），依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因 dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和 danZ 的产物。 因此，存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有 pMB1（或 ColE1） 复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚 2～3 千个质粒。 3. 质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性 它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象 不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中 两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。 而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现 30 多个不相容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。 4. 转移性 质粒具转移性。 它是指在自然条件下，很多质粒可以通过细菌接合作用转移到新宿主内。 它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。 二、标记基因 按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。 选择标记用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来 筛选标记可用于将特殊表型的重组子挑选出来 （一）选择标记 1．氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化 β-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。 2．四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） 四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。 3．氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） 氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。 目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性 P1 噬菌体（也携带 Tn9）。 cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶 A 存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。 4．卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor） 卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3‘）-Ⅱ, 25kDa）的基因 氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。 在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。 5．琥珀突变抑制基因 supF 在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变（突变为 UAG），或乳白突变（突变为 UGA）。 supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密码子上编译酪氨酸。 如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和