跨骨膜物质转运的成像与定量.docx

跨骨膜溶质转运的成像与定量：肌肉-骨骼串扰的含义ABSTRACT已经知道，肌肉和骨骼是一个功能单位，在组织的发育期和维持期中，在生物学上是有交互的。人们已经发现肌源性因子（肌因子 myokines）在活体中影响骨的功能。但是，局部肌肉骨骼串扰的一个关键步骤，肌因子穿入骨骼的转运时间（transport times），还没有被原位定量或活体定量。在本研究中，我们通过共聚焦显微镜对模拟肌因子的荧光示踪剂进行追踪和建模，研究了骨膜的渗透性，它是肌肉-骨骼串扰的主要屏障。通过反射光共聚焦成像和时间序列性xz共聚焦成像，我们分别在完整的小鼠胫骨中观察到了骨膜表面边界线，以及示踪剂穿入骨膜边界内的过程。我们选择了四种荧光示踪剂，包括荧光素钠（376Da），右旋糖酐（3kDa，10kDa，以及40kDa），因为它们代表了肌因子分子量（MW）中很大一部分。我们发现：1）小鼠骨膜可以被三种示踪剂穿过，而8小时内有超过40%的40kDa示踪剂无法穿过，提示骨膜是半透性的，其半透性的临界MW差不多是40kDa，2）穿过骨膜（厚约60μm）的特征性穿入时间随示踪剂MW的增加而增加，符合这个公式： 由这个公式，就可以推断出各种肌因子的特征性穿入时间。为了实现有效的肌肉-骨骼串扰，几种可能的信号通路应当具有穿入时间比其生物活性时间短的特点，我们假定生物活性时间是其在体内分子半衰期的5倍。那么，预计诸如PGE2，IGF-1，IL-15和FGF-2这样的肌因子符合这个要求。总而言之，我们发展了一种新的成像方法，并用其研究了模拟肌因子的示踪剂穿过骨膜的过程，使得人们可以进行更深入的，生理学正常情况下和病理学条件下肌肉-骨骼交流的定量研究。Introduction不断出现的证据提示肌肉和骨骼是一个功能单位，在组织的发育期和维持期（1-3）相互交流。由骨骼肌分泌的可溶性因子（称为肌因子 myokines）可以影响骨的代谢（4-7）。这些肌因子包括生长因子（例如，胰岛素样生长因子-1[IGF-1]，成纤维生长因子-2[FGF-2]，以及转化生长因子β[TGF-β]），细胞因子（例如，白细胞介素[IL6和IL-5]），以及其它小信号分子（例如，前列腺素E2[PGE2]）。近期一项研究显示了由骨骼肌分泌的肌因子通过活化Wnt/β-联蛋白途径保护骨细胞免于皮质激素诱导的凋亡，这种保护作用在肌肉受电刺激时极大地增强（8）。肌肉还可以充当细胞和生长因子的一个重要来源，能促进骨的愈合（9），而肌肉祖细胞甚至还保有分化到成骨细胞谱系的能力（10，11）。在两个方向上都可以对骨和肌肉的交流进行操作。人们发现骨髓源性的间叶基质细胞（MSCs）可以通过释放生长因子刺激骨骼成肌细胞增殖（12）。另外，机械性刺激的MLO-Y4成骨细胞可以表达促合成因子，例如IGF-1，血管内皮生长因子（VEGF）或肝细胞生长因子（HGF），已经知道这些因子影响肌肉的重量及其对机械负荷的适应能力（13）。因此，理解肌肉和骨骼在功能上的相互作用对开发新的，高效的骨骼/肌肉恢复策略十分关键。骨膜是一层纤维膜，生理上将骨骼和肌肉组织分隔开来，既是肌/骨骼源性生长因子的功能目标，也是骨骼和肌肉之间溶质及液体交换的重要把门人（6，14）。骨膜分为不同的两层，外面的纤维层含有成纤维细胞，胶原，Sharpey纤维，以及大量的神经网和微血管网，内侧的形成层含有神经，毛细血管，以及成熟期间叶祖细胞（15-19）。作为多能间叶干细胞的储备池，形成层可以分化成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，以及骨骼肌细胞（20，21），骨膜是肌/骨骼源性生长因子的一个作用点。近期一项研究发现骨膜充当着肌因子IGF-1和IGF-2的富余受体，已知这两个因子是骨形成的强力调控因子（6）。此外，作为一个交界面，骨膜可以充当分子筛，控制着骨-肌肉串扰所涉及的各种信号因子的穿入和转运速率。到目前为止，骨膜被描述成从完全密封/不可渗透的液体融合屏障（22-25），到半透膜（26）的这样一类东西。最近一项研究用分离样本及达西定律（Darcy’s law）测出了山羊股骨和胫骨骨膜的液压电导。但是，骨膜对信号分子筛选的作用还没有被原位确定过。为了填补骨膜渗透性这方面的知识空白，并进一步阐明肌肉和骨骼相互交流的机制，我们发展了一种新的方法，用共聚焦显微镜来量化分子原位穿过无活性的骨膜这一过程。通过反射光成像，首先识别出了小鼠的胫骨骨膜，然后短暂地（temporally）追踪了荧光示踪剂穿入骨膜的这一过程，从中得知了骨膜的筛子特性。在分子量和骨膜的特征性穿入时间之间建立了经验公式。这些数据帮助我们分析了骨骼-肌肉串扰中限制着速率的步骤，并分析了可能参与这种交流的分子。新的方法及定量数据奠定了从生理条件和病理条件进一步研究肌肉-骨骼相互作用的基础。Material and