第二高通量筛选技术与中药作用机制研究.pptVIP

第二章 高通量筛选技术与中药作用机制研究 第一节高通量筛选技术与生物芯片技术 第二节 中药作用机制的研究方法 第三节 中药作用机制的研究策略 附：学习讨论思考题 一、高通量筛选技术 我国中药为筛选研究提供了一个巨大的资源库，并且在中医理论和中药已知疗效作用的指导下，使中药高通量筛选研究的实验设计，更具方向性、合理性。 高通量筛选技术在我国应用的起步较晚，且尚不规范。 高通量筛选技术的方法 我国的高通量筛选技术的发展 （1）中国医学科学院（国内首次）： 1996年引进Bionek2000型实验自动化工作站。 1998年引进Topcount微量闪烁计数器。 使放射配基实验、放射免疫实验等技术微量化、自动化。 （2）西安交通大学药学院首创细胞膜色谱：为化合物的体外高通量筛选提供了高选择性、高特异性、高效率的筛选手段。 （3）上海药物研究所、北京军事医学科学院：分别成立了药物筛选专门机构，开始从事大规模筛选工作。 高通量筛选技术的方法 1．自动化操作系统---自动加样、稀释、转移、洗脱、混合、温孵、检测、分析等程序化操作 2．高灵敏度的检测系统---检测可见光、紫外光、荧光比色，同位素放射活性和生物发光、化学发光测定等。如：荧光共聚焦扫描仪、激光扫描细胞仪等 3．高特异性体外筛选模型---生物芯片（如玻片、载体膜）或 微孔培养板（ 96孔、384孔、864孔、1536孔） 4．被筛样品管理库-----中药成分、各种活性蛋白等 5．数据采集系统----自动采集和检测记录系统数据 6. 数据传输处理系统----计算机对数据进行分析处理，根据要求，输出筛选报告 7．化合物结构与生物活性相关性分析系统---计算机软件进行分析 二、生物芯片技术 （一）蛋白芯片技术 （二）基因芯片技术 （三）细胞芯片技术（微孔培养板） （一）蛋白芯片技术 1. 蛋白（受体）芯片技术的制备及检测 （1）单成分作用蛋白靶标定位 （2）多成分作用蛋白靶标定位 天然蛋白与重组蛋白比较 显色单成分作用蛋白靶标定位检测 不显色单成分作用蛋白靶标定位检测 多成分作用的蛋白靶标定位检测 2. 抗体芯片技术的制备及检测 抗体芯片检测体液中活性蛋白成分 抗体芯片检测体液中活性蛋白 （二）基因芯片技术 1. 基因芯片的制备 （1）原位合成法----原位喷印合成或原位刻章合成法 卓立生物：人、小鼠、大鼠、模式植物的全基因组表达谱芯片 （2）合成点样法----选择特定的cDNA点样法 2.待检样品的制备------制成单链核酸 （1）DNA样本的制备-----制成单链DNA，检测DNA的同源性 （2）mRNA样本的制备---制成单链RNA，判断功能性基因活化状态 （3）cDNA样本的制备---提取mRNA，在经PCR逆转录成cDNA 3.杂交图谱的检测和数据处理 （1）溴化乙锭染色法 （2）荧光素或同位素标记探针法 （1）溴化乙锭染色法 （2）荧光素或同位素标记探针法 （三）细胞芯片技术 第二节 中药作用机制的研究方法 一、中药材料制备 二、中药作用机制研究方法 一、中药材料的制备 （一）直接中药材料 （二）体内吸收的中药成分材料 中药材料、血清药物材料、尿液药物材料比较 （一）直接中药材料 1. 中药水煎液：含有蛋白和多糖、小分子成分材料 2. 水提醇沉（或其他有机溶剂）上清：去除蛋白和多糖的中药小分子成分 3. 有机溶剂提取物：主要为小分子成分 4. 中药成分纯品：如中药成分标准品 （二）体内吸收的中药成分材料 二、中药作用机制研究方法 （一）中药作用靶标定位研究 1、分子靶标定位研究 2、细胞靶标定位研究 （二）中药对靶细胞作用的研究 （三）中药复方对证候模型作用的研究 1、分子靶标定位研究 2、细胞靶标定位研究 （二）中药对细胞作用的研究 （1）靶细胞的制备与处理 （2）靶细胞芯片的制备与检测 （1）靶细胞的制备与处理 以靶标分别为CD4、CD3的中药成分为例： ①致敏免疫细胞特异性激活作用：提取结核病人白细胞，在培养瓶内，加药物+结核杆菌刺激，孵育培养后，制备靶细胞芯片。 ②免疫细胞非特异性激活作用：提取正常人白细胞，在培养瓶内，加药物+PHA刺激，孵育培养后，制备靶细胞芯片。 （2）靶细胞芯片制备与活性检测 （三）中药复方对证候细胞作用的研究 1、经典复方成分的靶标定位----选定药物作用的靶细胞 如：四君子汤----气虚证；四物汤----血虚证； 肾气丸------肾气虚证；六味地黄丸----肾阴虚证 2、证候模型建立、处理与检测---