实验六、细胞骨架的观察 lz课件.pptVIP

细胞骨架的观察 实验设计范围 细胞凋亡 原代细胞培养和鉴定 细胞及细胞器的结构、成分及组装机制 细胞骨架和分子马达 细胞信号转导 细胞周期 细胞分化 细胞运动 细胞通讯 细胞内物质运输 如何写作 标题 背景介绍 （该实验设计的意义何在） 材料 实验步骤 （有些实验需要考虑阴性、阳性对照的设立） 可能的实验结果 有可能出问题的地方 参考文献 【实验目的】 掌握用鬼笔环肽染色法观察细胞骨架的方法。 【实验原理】 细胞骨架(Cytoskeleton) 主要包括微管、微丝和中间纤维以及核骨架-核纤层体系。微管主要分布在核周围，呈放射状向四周扩散，微丝主要分布于细胞质膜的内侧，而中间纤维则分布在整个细胞中。 细胞骨架具有维持细胞形态结构和内部结构的有序性、参与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和细胞分裂等重要功能，因此对细胞骨架的研究也是近代细胞生物学中最活跃的领域之一。 通常使用免疫荧光显微镜观察等方法对细胞骨架进行研究。 常用的细胞骨架的观察方法有：考马司亮兰R250染色法、荧光素标记的鬼笔环肽染色法、间接免疫荧光法等。 考马斯亮蓝R250可以对各种蛋白质进行染色。细胞骨架有一个特性，即用非离子去垢剂（如Triton X-100）处理时，可以保持非溶解状态。当用这类试剂处理细胞时，细胞内其它可溶性的物质和膜成分都被抽提出来，只留下细胞骨架。考马斯亮蓝R250虽不能对微丝进行特异性染色，但当其它蛋白成分被抽提后，就能清晰地显示微丝束的形态。 鬼笔环肽(phalloidin)是从毒蕈（Amanita phallodies）中提取的环肽，与各种细胞的丝状肌动蛋白都有很强的亲合作用。用荧光素偶联的鬼笔环肽与微丝结合后，在荧光显微镜下可以清晰地观察到细胞中的微丝。 [实验器材、材料和试剂] 显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染色缸、载玻片、盖玻片； 洋葱鳞茎内表皮、6mM磷酸盐缓冲液（pH6.8,用NaHCO3调节）、M缓冲液、1%Triton X-100（用M缓冲液配制）、0.2%考马斯亮蓝R250（配制溶剂为甲醇:冰乙酸:水＝46.5:7:46.5）、3%戊二醛（用6 mmol/L 磷酸盐缓冲液配制）、50%,70%,95%乙醇。 [实验步骤] 1、撕取洋葱鳞茎内表皮（约1平方厘米大小若干片）置于pH6.8磷酸缓冲液中，待其下沉； 2、吸去磷酸缓冲液，用1%Triton X-100处理20～30分钟； 3、吸去Triton X-100，用M缓冲液冲洗三次，每次10分钟； 4、3%戊二醛固定0.5～1小时； 5、pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次10分钟，滤纸吸去残液； 6、0.2%考马斯亮蓝R250染色20～30分钟，然后用蒸馏水小心冲洗1～2次； 7、将表皮铺放在载玻片上，加盖玻片，在高倍显微镜或者油镜下进行观察。 * *