重组腺病毒介导P27mt基因增强宫颈癌放疗疗效的实验研究.docVIP

重组腺病毒介导P27mt基因增强宫颈癌放疗疗效的实验研究 　　【中图分类号】R711 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2013）12-0250-01 　　【摘要】目的 观察P27mt基因对宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用。方法 MTT法检测P27mt基因和放射线对Hela细胞的增殖抑制作用，绘制抑制率曲线图研究P27mt基因与放射联合应用时的作用特点；流式细胞法检测细胞周期和凋亡。结果 单纯照射对宫颈癌增殖有抑制作用，但有平台效应；P27mt基因对Hela细胞增殖具有明显的抑制作用，并呈时间和浓度依赖性；照射联用P27mt基因可进一步增强对宫颈癌的杀伤效应；单独照射和P27mt基因均能使细胞周期阻滞于放射敏感时相G2/M期，诱导细胞凋亡，联用效果更加显著。结论P27mt基因可通过阻滞细胞周期于G2/M期对宫颈癌Hela细胞产生放疗增敏作用。 　　宫颈癌是我国也是本地区最常见恶性肿瘤，放射治疗是重要治疗手段，目前多采用同步放化疗综合治疗模式，即通过同步应用小剂量化疗药物在不增加甚至降低射线剂量的基础上达到增强放射线对肿瘤细胞的杀伤作用[1] 。 　　p27 基因是细胞周期素依赖性激酶抑制因子（CDKI） 家族成员之一，是一类重要的细胞周期调控基因，可广泛抑制细胞周期素（ cyclin） 和细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK） 复合物的活性对细胞周期进行负性调控[2] 。Jean 等[3] 将p27 第187 位苏氨酸置换成丙氨酸（T187A） 转染HeyC2 细胞，发现细胞生长明显抑制，证实突变p27 （p27mt） 比野生型p27 抑制作用更强。p27mt对宫颈癌放疗作用如何未见有人报道，本文对此进行了研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　人宫颈癌Hela细胞株和p27mt 由湖北医药学院临床研究所惠赠； Clinac 600C/D加速器（ 美国Varian 公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coluter公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1细胞培养 宫颈癌Hela细胞培养于含10%新生牛血清的1640中，并置于含5%C02的37℃孵箱中常规培养，每2-3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。 　　1.2.2照射方法 在室温下采用6MV-X线照射，照射野10×10cm，剂量率40 cGy/min，源皮距为100cm，分别一次性给予各实验组6、8、10、12、14、16Gy剂量。 　　1.2.3放射线对Hela细胞增殖的影响 取对数生长期Hela细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，参照文献按辐射剂量分为6、8、10、12、14、16Gy共6组，每组设5个复孔，给予一次性射线照射12、24、48h后，每孔加入20μL MTT（5g/L），继续孵育4h，弃各孔液体，每孔加入150μL二甲基砜，低速震荡10min，酶标仪检测各孔在562nm波长处吸光度值，计算抑制率，求出辐射剂量坪值，即细胞增殖抑制率达最高的射线剂量。细胞抑制率=（1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值） ×100%。 　　1.2.4MTT法测定p27mt的辐射敏感性 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，分为空白组、单药组、单放组、药放组。空白组只加细胞与培养液；单放组剂量取上述实验的坪值；单药组p27mt基因终浓度参照文献[4] 确定为10、20，30，40，50MOL（感染复数）共5组，药放组辐射剂量和药物浓度分别同单放组剂量和单药组浓度，共5组，每组设5个平行样本，测定各组吸光值后通过公式计算细胞抑制率。 　　1.2.5细胞周期分析及凋亡检测 细胞分组及处理同1.2.4，取处理完毕的4组细胞各1×106个， PBS洗2次，加入70%冷乙醇4℃固定过夜，清除固定液，加入PBS100μl混匀细胞，再加入10g/LRNAase2μl充分混匀，置37℃水浴锅中加温30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常温避光30min后，流式细胞仪检测，Multicycle软件分析，拟合计算出细胞各时相百分比和凋亡率。 　　1.3统计学分析 所得数据以均数±标准差（x±s）的形式表示，SPSS17.0软件模拟生存曲线并进行单因素方差分析（两两比较采用S-N-K法），以P0.05为差别有统计学意义，以P0.01为差别有显著性统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 Hela细胞对射线照射的敏感性 射线照射对宫颈癌细胞增殖可产生明显的抑制作用，在射线剂量12Gy以内时，随着射线剂量的加大和照射后作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率也明显增加，呈现出一定的量效和时效关系。在12Gy处出现坪值，故选用12Gy加药物进行后续的增敏实验。 　　2.2p27mt基因对Hela细胞增殖的影响