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响应面法优化复方中药发酵工艺 　　摘要：目的 考察复方中药制剂发酵过程中的影响因素，通过单因素试验及响应面法，确定其最佳发酵工艺。方法 通过控制复方中药发酵过程中的因素（如发酵菌种、发酵时间、发酵温度、接种量等），采用高效液相色谱法（HPLC），以其总峰面积提高率为指标，对发酵前后醇提液进行监控和对比评价，并采用响应面法确定其最佳发酵工艺。结果 经单因素试验及响应面法确定的最佳发酵工艺为：以SZ-2为发酵菌种，温度33 ℃，接种量4%，发酵3.5 d，其总峰面积提高率平均可达31.24%。结论 可以用HPLC指纹图谱对不同影响因素下的复方中药制剂发酵进行对比及评价，并通过响应面法明确其最佳发酵工艺，为其发酵工艺开发提供了参考。 　　关键词：复方中药；发酵工艺；高效液相色谱法；单因素试验；响应面法 　　中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0073-05 　　中药经净制或处理后，在一定温度和湿度条件下，利用霉菌和酶的催化分解作用，使药物发泡、生衣的方法称为发酵法[1]。发酵是一种重要的炮制方法，目的是改变原有药性，产生新的治疗作用，扩大药物品种，并具有去毒存效、增强药效、提高中药提取率等作用[2]。随着生物技术的不断发展以及微生物越来越受到广泛关注，微生物发酵为中药炮制的发展开辟了新的研究空间。但传统的中药发酵采用天然微生物发酵，菌种不纯，代谢理论、药效成分理念模糊不清，生产可控性差，且发酵中药所包含的成分极其复杂，对其成分分离纯化有较大难度，中药发酵研究有限，投入生产的品种更少。鉴于发酵类中药成分复杂，缺乏指标性成分，以高效液相色谱法（HPLC）测定发酵后醇提液的总峰面积来代表发酵后总有效化学成分含量，对复方中药制剂质量评价有一定的参考意义。 　　本试验以某企业委托的一种复方中药制剂为研究对象，因其传统的发酵炮制工艺生产周期较长，且制剂的质量难以控制，故通过对复方中药发酵过程中影响因素（如发酵菌种、发酵时间、发酵温度、接种量等）进行优化筛选，并采用HPLC分离分析技术测定，对发酵前后醇提液进行监控和对比评价，由响应面法分析确定最佳发酵工艺，为复方中药发酵工艺开发提供一定的基础和参考。 　　1 仪器与试药 　　Surveryor高效液相色谱分析仪（美国 Finnigan）， SHP生化培养箱、净化工作台（扬州鸿都电子有限公司），ZD-85气浴恒温振荡器（金坛市荣华仪器制造有限公司），HH-S4型电热恒温水浴锅、DZF型真空干燥箱（北京利伟永兴仪器有限公司），RE-3000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司），KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。分析纯乙醇，色谱甲醇以及无菌水。 　　复方中药及其组方药味由某公司提供（委托方要求复方中药及组方保密）；发酵菌种为酒曲，均来自市场商品，分别为醇正醇牌第四代“高效增香型酒曲”（哈尔滨醇正醇酒曲厂）、苏州蜜蜂牌“甜酒曲”（苏州粮油食品有限公司）、安琪牌“甜酒曲”HY12-11、ANGEL、Q/YB2002S（安琪酵母股份有限公司），分别命名为CZC-4、SZ-2、AQ-1、AQ-2、AQ-3。 　　2 方法 　　2.1 工艺流程 　　2.2 工艺要点 　　2.2.1 浸泡、蒸煮及灭菌 精确称取复方中药原料5.000 5 g，加无菌水至药材表面，浸泡2～3 h，高温（100 ℃）蒸煮1～2 h，至水分被药材完全吸收，密封置于紫外灯下灭菌，待温度降至室温时，放置无菌恒温箱（33 ℃）中备用。 　　2.2.2 活化 精确称取发酵菌种0.150 5 g，置于灭菌后的试管中，于净化工作台上加入约3 mL无菌水，加棉花塞，放置恒温振荡器中，500 r/min，活化0.5 h。 　　2.2.3 接种 取出恒温箱中药材（发酵培养基），将活化后的菌种倒置药材表面，边搅拌，边接种。再用少许无菌水将试管壁上的菌种涮下。上述操作过程尽可能迅速完成，以确保菌种的发酵温度维持在一个最适的范围，缩短发酵周期。 　　2.2.4 发酵 取出接种后的药材，密封置于恒温培养箱中，33 ℃发酵至醇香产生，一般为3～5 d。 　　2.2.5 制样 将发酵后的药材，按固液比1∶15，80%乙醇热回流提取2 h，提取2次，抽滤，收集滤液，经真空浓缩至膏状无醇味；将浓缩液浸膏用无水甲醇溶解洗涤，定量转移至250 mL容量瓶中，无水甲醇定容至刻度备用。 　　2.3 分离分析检测与评价依据 　　采用HPLC进行分离分析[3-4]，测定复方中药制剂中各组分的色谱峰面积，依据各组分色谱峰面积的变化来评价复方中药制剂发酵炮制效果的优劣，色谱峰面积越大说明发酵后有效化学成分含量越