重组DNA技术20100613.pptVIP

重组DNA技术 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验: 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系 (二)目的基因 进行DNA重组的目的主要有两方面： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 这些使我们感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因(target DNA)。 目的基因有两种类型： cDNA(complementary DNA):在体外经反转录合成的．与mRNA互补的DNA。 基因组DNA(Genomic DNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。 (三)载体 一.表达载体(expression vector): 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 二.克隆载体(Cloning vector): 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 第二节 重要的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 常用质粒载体 （一） pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点： （1）含有复制起始点和复制调节信号； （2）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因； （3）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便于重组体细胞的筛选。 （二） pUC系列载体: 由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点： ①具有更小的分子量和更高的拷贝数。 ② “蓝白斑”筛选: pUC载体中的LacZ′基因可编码β-半乳糖苷酶（β-Gal）N端的α-肽链，该α-肽与宿主细胞(如E.coli JM109）中F′因子上的LacZ′△M15基因（α-肽缺陷型）的产物互补，产生完整的、有活性的β-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成蓝色菌落。当外源基因插入MCS后，LacZ′α-肽基因的读码框被破坏，不能合成完整的β-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。称为“蓝白斑”筛选。 （三）其它质粒载体 1．能在体外转录克隆基因的质粒载体: T7、SP6的启动子(RNA聚合酶附着位点) 2．穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）: 具有两种不同复制起点和选择标记,在原核和真核细胞之间往返穿梭. （四）T-A克隆载体 多克隆位点两侧的3′末端携带有未配对的T碱基。由于许多耐热的DNA聚合酶（如Taq、Tth等）扩增时都有在PCR产物3′末端加上A碱基的特性，因此在连接酶的作用下可直接将PCR产物插入到T-A载体中。获取、连接外源DNA不受酶切位点的限制。 二、噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒。 （一）λ噬菌体载体 1．λ噬菌体的特点 线状双链DNA，全长48 502bp，由左右两臂组成，两端为12碱基组成的彼此完全互补的5′单链突出黏性末端，称为cos位点。 感染细菌后，可进入溶菌生命周期及溶源生命周期。 优点：可插入较大外源DNA片段（可达23kb）；感染效率远高于质粒载体。 2．λ噬菌体载体的构建 优点：可插入较大外源DNA片段（可达23kb）；噬菌体的感染效率高 （二）粘粒载体 结构与特点： 1．含有cos黏性末端及与噬菌体包装有关的短序列 2．含有抗药性标记（如Ampr基因）和自主复制成分 3．具有限制性内切酶位点 4．粘粒分子小 如pJB8为5.4kb，所以可插入大片段的外源DNA（可达45kb） 5．某些粘粒若接上能在真核细胞生活的元件及选择标记，便可作为穿梭载体在真核细胞中生存及表达。 （三）M13噬菌体载体 M13是一种丝状单链噬菌体，6 407bp，为闭环单链DNA。 M13只能感染具有F伞毛的雄性大肠杆菌，在细菌内复制时形成双链DNA，这种复制型（replication form，RF）M13相当于质粒，可用作基因克隆载体。 三、人工染色体载体 酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome vector，YAC）是第一个成功构建的人工染色体载体,主要包括以下调控元件： ①着丝粒（centromere，CEN），以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞； ②端粒（telomere，TEL），作为染色体复制所必需的成分，可防止染色体被核酸外切酶降解而缩短； ③复制起始点和限制性酶切位点； ④选择标记； ⑤原核序列及调控元件：复制起始点、Ampr基因等，以便于在大肠杆菌中操作。 四、病毒载体 质粒载体、噬菌体载体主要以原核细胞作为宿主细胞。为实现真核基