重组人高密度脂蛋白B族I型清道夫受体基因腺相关病毒血清型2／1杂合载体在HepG2肝细胞的表达.docVIP

重组人高密度脂蛋白Ｂ族Ｉ型清道夫受体基因腺相关病毒血清型２／１杂合载体在ＨｅｐＧ２肝细胞的表达 　　作者：张玉玲，伍卫，周淑娴，雷娟 作者单位：附属第二医院心血管内科， 广东 广州 510120; 2. 附属第五医院心血管内科， 广东 珠海 519000 　　【摘要】 构建含绿色荧光蛋白(EGFP)重组人高密度脂蛋白B族I型清道夫受体(SR-BI)基因腺相关病毒(rAAV)2/1杂合载体，观察其在HepG2肝细胞的表达。【方法】以pCMV.SPORT6-SR-BI质粒为模板PCR扩增目的基因cDNA，将其克隆至pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa载体中，经酶切及测序鉴定后，脂质体介导转染BHK21细胞，经G418筛选得到含SR-BI基因的BHK/SR-BI-IRES-EGFP载体细胞株，用携带rep2-cap1基因的辅助病毒(rHsv/r2cl)感染该细胞株。通过细胞孵育、裂解和病毒纯化，得到杂合载体rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒。免疫荧光显微镜检测绿色荧光表达，计算转染效率，Western Blot检测转染后SR-BI蛋白的表达。 【结果】 酶切鉴定表明pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP重组成功，基因测序显示装入pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa质粒中的SR-BI基因正确;成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒载体。转染HepG2肝细胞后免疫荧光显微镜检测最佳MOI值为1 × 105时， 以此值转染HepG2肝细胞荧光高效表达; Western Blot检测未转染组及rAAV2/1-IRES-EGFP组HepG2肝细胞均有SR-BI蛋白表达，rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP组SR-BI蛋白表达水平较rAAV2/1-IRES-EGFP组及未转染组显著增加。【结论】 成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP杂合载体系统，转染后SR-BI蛋白在HepG2肝细胞高效表达，为SR-BI生理学作用机制及临床应用的深入研究奠定基础. 　　【关键词】 高密度脂蛋白; B族I型清道夫受体; 腺相关病毒; HepG2肝细胞 　　Expression of Adeno-associated Virus Vector Serotype 2/1 Containing HumanScavenger Receptor Class B Type I Gene and Its Expressionin in HepG2 Hepatoma Cells　ZHANG Yu-ling， WU Wei， ZHOU Shu-xian， LEI Juan　1. Department of Cardiology， The Second Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China;. Department of Cardiology， The Fifth Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Zhuhai 519000， China　Abstract： 【Objective】 The recombinant adeno-associated virus serotype 2/1 (rAAV2/1) hybrid vector containing human scavenger receptor class B type I gene (SR-BI) was constructed and its expression was examined in human HepG2 hepatoma cells.【Methods】 The SR-BI cDNA which was obtained by PCR from pCMV.SPORT6-SR-BI plasmid was inserted into the AAV vector plasmid pSNAV2.0 -IRES-EGFP-LacZa. The recombinant plasmid pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP was transfected into BHK21 cells by LipofactamineTM2000 after being identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. The rAAV vector producing cells were selected with G418. The G418