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实验十四 碱性磷酸酶米氏常数的测定 一、目的要求 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。 二、原理 酶促反应v-[S]曲线 v [S] 推导出米氏方程为： 其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数 米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即： 以1/v对1/[S]作图，可得一条直线 1/v 1/Vm -1/Km 1/[S] 本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm. 反应式：pNPP+H2O pNP+HPO42- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。 三、试剂与器材 试剂： 0.5?mol/mL pNP 、10 mmol/L pNPP、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸钠—碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.2 mol/L NaOH、6 mg/mL碱性磷酸酶酶液 器材：恒温水浴锅、722分光光度计 四、操作方法 （一）对硝基苯酚标准曲线的制作（不做） 取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作： 管 号 0 1 2 3 4 5 6 pNP含量 (?mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.5?mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H2O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Na2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL 0.2 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL OD 405 nm? 以对硝基苯酚的绝对量(?mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数(?)值。 (二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。 No. 1 2 3 4 5 底物终浓度[S] (mM ) 0.5 0.75 1.0 1.5 3 10 mmol/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6 蒸馏水（mL ） 0.6 0.55 0.5 0.4 0.1 碳酸盐缓冲液（mL ）
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