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二、用固体培养基分离纯培养 4、厌氧微生物的分离 厌氧罐 厌氧手套箱 二、用固体培养基分离纯培养 4、厌氧微生物的分离 稀释摇管法 三、用液体培养基分离纯培养 稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中,大多数(一般应超过95%)表现为不生长。 1878年,Lister 分离乳酸链球菌时所使用的微量注射器和酒杯培养装置,注射器的最小吸取量: 0.00062 毫升 四、单细胞(孢子)分离 一般采用显微操作仪,在显微镜下进行; 操作难度与细胞或个体的大小成反比; 五、选择培养分离 抑制大多数其它微生物的生长; 使待分离的微生物生长更快; 使待分离的微生物在群落中的数量上升, 方便用稀释法对其进行纯化。 微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化: (没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物 生长的要求,在一定程度上所有的培养基都是选择性的。) 使待分离的微生物生长“突出”; 直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。 五、选择培养分离 1. 利用选择平板进行直接分离 待分离的微生物生长,其它微生物的生长被抑制 高温下培养:分离嗜热细菌; 培养基中不含N:分离固氮菌; 培养基加抗生素:分离抗性菌; 五、选择培养分离 1. 利用选择平板进行直接分离 待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物 颜色反应:分离特定的菌株; 牛奶平板:分离蛋白酶产生菌; 利用特定细菌的滑动特点进行 分离纯化; 五、选择培养分离 2. 富集培养 从自然界中分离到所需的特定微生物 特定的环境条件 仅适应于该条件的微生物旺盛生长 待分离微生物在群落中的数量大大增加 2. 富集培养 富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理 条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微 生物的需要。 根据微生物的特殊要求,从自然界分离出特定已知微生物种类; 分离培养在特定环境中能生长的微生物; 六、二元培养物 培养物中只含有二种微生物,而且是有意识的 保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。 病毒和宿主细胞; 纤毛虫、变形虫和粘细菌; 微生物学实验室的常规操作程序 六、 菌种保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求,否则 生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素: a)变异; b)污染; c)死亡; 不衰 不乱 不死 1、菌种的衰退与复壮 菌种衰退: 菌种在培养或保藏过程中,由于自发突变的存在,出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象,称为菌种的衰退。 衰退原因: ①基因突变,②分离现象。 衰退现象: 菌落和细胞形态的改变; 生长速度缓慢,产孢子越来越少; 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降; 防止衰退的措施: 1)减少传代次数; 2)创造良好的培养条件; 3)经常进行纯种分离,并对相应的性状指标进行检查; 4)采用有效的菌种保藏方法; 1)从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来,重新获得具有 原有典型性状的菌种。 2)有意识地利用微生物会发生自发突变的特性,在日常的菌种 维护工作中不断筛选“正变”个体。 菌种的复壮: a)纯种分离; b)通过寄主体进行复壮; c)淘汰已衰退的个体 菌种保藏机构的任务:广泛收集科研和生产菌种、菌株,并加以妥善保管,使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。 菌种保藏机构: 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所(NCTC) 法国里昂巴斯德研究所(IPL) 国内外菌种保藏机构: 2、菌种保藏 基本方法: 生活态 (传代) 休眠态 培养基传代培养 寄主传代培养 冷冻 干燥 斜面、平板 液氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥 原理:选用优良的纯种,(最好是休眠体,如分生孢子、芽胞等),创造降低微生物代谢活动强度,生长繁殖受抑制,难以发生突变的环境条件。(其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等) 1)低温保藏法方法:菌种管置4℃冰箱保藏,定时传代 原理:低温下,微生物代谢强度明显下降 。2)石蜡油低温保藏法橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。 3)悬液保藏法 1)真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物, 便于大量保藏,菌种存活时间长,是目前最好的保藏方法。 2)砂土管法 适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏, 保藏时间几至几十年。 传代培养保藏 1)液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中,预冻后保存在液氮超低温冰箱中 ( -196℃)
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