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临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法 卫生部临床检验中心 李金明 临床标本的正确采集、运送、保存的重要性 临床检验的质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一 核酸提取的重要性 核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分,亦是手式操作的主要部分 核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否 临床PCR检验操作中最易出问题的环节 标本采集 标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备 标本的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染 标本运送 样本一经采集,则应尽可能快的送至检测实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性,对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。 临床标本的处理和保存 血清(浆) 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织 血清(浆) DNA测定,可按照一般的血清标本处理程序,对测定影响不大。 RNA测定,标本的获取和保存方式对测定结果,可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素,因其对PCR扩增有抑制,且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本,抗凝后6小时内分离血浆,如使用血清标本,则需尽快(2小时内)分离血清,标本的短期(1~2周)保存可在-20℃下,较长期保存应在-70℃下。 全血 以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素。 全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期保存,如用于RNA检测,则应在取血后,尽快提取RNA 。 外周血单个核细胞 外周血单个核细胞可从抗凝全血制备,主要有两条途径,一是使用淋巴细胞分离液分离制备;二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70℃下. 痰 痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本。 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需对样本进行初步处理,即用1 mol/L NaOH或变性剂液化。 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测,痰标本只能室温悬浮于生理盐水中,充分振荡混匀,促使大块粘状物下沉,取上清离心,所得到的沉淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃下。 痰标本处理的基本模式 通用模式 简单模式 痰标本处理通用模式 试剂:(1)通用标本处理(Universal sample processing, USP)溶液:由4-6 mol/L盐酸胍(GuHCl),50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 25 mmol/L EDTA, 0.5%Sarkosyl和0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。(2)0.05%Tween 80。(3)10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20) 痰标本处理简单模式 试剂:(1)裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白酶K和0.05% Triton X-100 痰标本处理中要注意的问题 痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情况下,不能采用异硫氰酸胍盐(GuSCN)方法提取。采用这种方法提取,有可能会在提取过程中,出现一种可修饰DNA的酶,在最后一步提取中,与核酸一起洗提出来,从而抑制其后的扩增。 在PCR主反应混合液中,加入α-酪蛋白(alpha-casein)、白蛋白等,有防止此类抑制物产生的效果。 棉拭子 在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5~10分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。 如不立即用于核酸提取,则需保存于-70℃下. 脓液 脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式,先进行液化,再离心取沉淀提取DNA;水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗2~3次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。 沉淀标本的保存条件同样为-70℃。 体液 临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。 乳汁 乳汁有时也可作为标本,如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的PCR检测。 乳汁中布鲁菌DNA的提取 试剂准
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