亲和层析技术要点课件.ppt

亲和层析纯化技术要点 6th Group 生物制药工艺上主要运用的几种色谱技术 Affinity Chromatography 亲和层析技术概述 What is Affinity Chromatography? 亲和层析是利用生物体中多数大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的分离纯化技术 其专一性是由分子有关作用基团（官能团）的化学结构与它们的空间排列决定的 亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生物太分子最重要的方法之一 Background 生物大分子自身的特殊性和复杂性：热稳定性差，对环境的pH值、有机溶剂、某些无机载体和金属离子很敏感。 因此欲高效分离纯化存在于相当大体积的组织匀浆或发酵液中的极少量目标产物，同时又混有大量理化性质相仿的其它生物活性物质时，仅根据理化性质不同设计分离纯化工艺已远不能满足生物技术发展的需要。这时就必须从生物亲和作用力的角度进行研究，而亲和技术正是在此背景下产生的。 亲和层析发展史 基本概念 亲和作用：生物物质具有识别特定物质并与该物质分子结合的能力，且可以区分结构与性质相似的其他分子，这种特异性的相互作用称为亲和作用。 配基:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。 配体：与配基是相对的概念。 配基应具备的特性： 1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 2.必须具备能被修饰的功能基团 亲和层析的特点 亲和层析基本过程 ?配基固定化 ? (Immobilise) ? 基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的物质。 洗脱方法 亲和层析的基本类型 生物亲和层析 免疫亲和层析 金属离子螯合亲和层析 染料亲和层析 拟生物亲和层析 金属离子螯合亲和层析 金属离子螯合亲和层析是利用金属离子的络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。 Ni Sepharose 6 Fast Flow 含His-tag的rhEGF： His的咪唑基可以与Ni2+特异性结合。 常见问题 Tips 一些从实验手册里总结出来的Tips 1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4+，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等； 2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等； 3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原，比如DTT，防止二价Ni被还原； 4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失； 5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解； 6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v） 7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质； 8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间； 9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M） 10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染； Click to edit company slogan . 一、His标签蛋白没有结合上，都流穿了 可能原因1：超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶 可能原因2：样品或者是结合缓冲液不正确策略：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液 中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。 一、His标签蛋白没有结合上，都流穿了 可能原因3：组氨酸的标签没有完全的暴露策略：在变性条件下(用4－8 M 脲，或4－6 M盐酸胍)进行纯化。? 可能原因4：His标签丢失策略1：WB或者anti-his的抗体检查His是否表达，上游构建，改变his-tag的位置(C-terminal or N-terminal)，必要时增加his个数(常用6-10个)。策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。 二、His标签蛋白与Ni2+结合了，没有被洗脱下来 可能原因：洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。? 可能原因：蛋白已沉淀在柱上策略：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。? 可能原因：非特异性疏水或其他相互反应策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的浓度。 层析柱堵塞 可能原因：细胞碎片 解