何水林版基因工程 第二章 基因克隆的工具酶课件.ppt

第二章　基因克隆的工具酶 周毅峰 2013春 ④　DNA的分子结构 　DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。 某些核酸内切限制酶切割超盘旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。 此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。 ⑤　核酸内切限制酶的缓冲液 核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl，?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。 酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。不正确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。 缓冲液Tris-HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.4的条件下，其功能最佳。 巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性 有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感 而另一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离子强度的变化幅度 BSA的作用 酶保护剂，在反应中保证酶具有最佳的活性 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的星号活性（Star activity）现象 EcoR I在正常条件下识别并切割5′GAATTC3′序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5′PuPuATPyPy3′或者5′AATT3′ 不同的酶生产厂家适合各种不同反应的缓冲液 Takara NEB LTI (Gibcol-BRL) Promega Roche MBI 华 美 Takara 美国总部： Beverly, MA 缓冲液成份(1x)： NEBuffer 1 (黄色)：10 mM Bis Tris 丙烷-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7.0 25°C)。 NEBuffer 2 (蓝色)： 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 25°C)。 NEBuffer 3 (红色)： 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 25°C)。 NEBuffer 4 (绿色)： 20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg（Ac）2, 50 mM KAc, 1 mM DTT (pH 7.9 25°C)。 NEB缓冲液 NEB稀释缓冲液成份：稀释液A：50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 μg/ml BSA和50% 甘油(pH 7.4 25°C)。稀释液B：300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 500 μg/ml BSA和50%甘(pH7.4 25°C)。稀释液C：250 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.15% Triton X-100, 200 μg/ml BSA和50%甘油(pH 7.4 25°C)。 ATP依赖的DNA连接酶 NAD＋依赖的DNA连接酶 大多数原核生物DNA连接酶 真核生物和病毒DNA连接酶，如T4DNA连接酶、真核生物DNA连接酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 2　DNA连接酶 DNA连接酶（ligase）：在一条DNA链的3′末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5′-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在2条DNA链之间形成的磷酸二酯键 用于共价连接DNA限制片段的连接酶有两种不同的来源 由Ecoli染色体编码的DNA连接酶 由Ecoli T4噬菌体DNA编码的T4DNA连接酶 用NAD+作能源辅助因子 ATP作能源辅助因子 DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50-100 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM ATP 0.5 - 1mM DTT 5 mM Volume 10 - 20μl Tep. and Time 4-15 ℃, 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时，完全连接 1 μgλ DNA（Hind III片段）所需的酶量 平末端DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平末端的连接则属于分