第六章 蛋白质的分离、纯化.ppt

一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质中的功能团　 末端α－NH2　　 末端α－COOH　　 侧链基团 所以，蛋白质的化学物理性质＝AA A．蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用。　B．蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团。　C．结合蛋白质 辅基成分包含可解离蛋白质　D．末端α-COOH, α-NH2　E．蛋白质分子中可解离基团的pK和游离AA中相应基团的pK值完全不相同。　　∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响　F．蛋白质可看作一个多价离子 蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pH称为蛋白质等电点 等离子点--没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等离子点。特征常数。 二．蛋白质分子的大小与形状 ㈥．利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 ㈥．利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率 这样造成两个后果： 　①　SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。　　　因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极移动。　② 改变了蛋白质单体分子的构象。 SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有下列关系 三．蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀 1．蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是分散系统：分散相是蛋白质分子颗粒，分散介质是水。分散程度胶体系统分散相质点真溶液（质点是分子，均相系统） 分散程度--以分散相质点的直径来衡量 根据分散程度： 分散相质点在胶体系统中保持稳定需三个条件： a． 分散相质点1-100nm b． 分散相质点带有同种电荷，互相排斥不聚成颗粒而沉淀 c． 分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层 蛋白质： a. 胶体质点的范围 c． 丁达尔效应d． 布朗运动e． 不能透过半透膜 2．蛋白质的沉淀 沉淀蛋白质的方法： ① 盐析法： 中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→ 蛋白质脱去水化层优点：不引起蛋白质变性② 有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 条件：低温操作 缩短时间 ③ 重金属盐沉淀法 当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子 　 　　　　　　　　　　　　　(Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀用途：抢救误服重金属盐的病人 ④　生物碱试剂和某些酸类沉淀法 生物碱试剂－－能引起生物碱沉淀的一类试剂 当溶液pHpI时,蛋白质颗粒带正电荷→ 易与生物碱试剂,酸根负离子反应→沉淀用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质 ⑤　加热变性测定法 原因：a． 加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层b． 蛋白质处于等电点破坏了带电状态。用途：制豆腐（加热+少量盐卤） 四 蛋白质分离提纯的一般原则  蛋白质提纯的总目标--增加制品纯度或比活性、几增加单位蛋白质质量中所要蛋白质的含量或生物活性。 ① 前处理： ② 粗分离 蛋白质混合提取液∣∣盐析法、等电沉淀、有机溶剂↓所要蛋白质与其他杂蛋白质分开特点：简便、处理量大、既能除去大量杂，又能浓缩蛋白质溶液。 ③ 细分离 ④ 结晶：本身伴随着一定程度的提纯　重结晶：可除去少量夹杂的蛋白质蛋白质纯度愈高、溶液愈浓就愈容易结晶 五 蛋白质混合物的分离方法 (一）据分子大小不同的分离方法 　1．透析和超过滤 利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 超过滤 利用压力或离心力，强行使水和其他小分子通过半透 膜，而蛋白质留在膜上。 2 密度梯度（区带）离心 原理 3 凝胶过滤 （凝胶过滤层析，分子排阻层析） （分子筛层析，凝胶渗透层析）根据分子分离蛋白质混合物 ⑴ 凝胶过滤的介质 常用介质： (1) Sephadex: (交联葡聚糖) G25, G50, G75, G100 Bio-gel: (聚丙烯酰胺) P-6，P-30，P-60，P-100 Sepharose: (琼脂糖) 2B, 4B, 6B (2) Sephacryl: S100, S200, S300 (3) Superose: HPLC (4) s