4连接.ppt

重组质粒的连接 材料、设备及试剂 一、 材料 　　外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: T-vector(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知. 二、 设备 　　台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液枪，eppendorf管。 三、 试剂 　　1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L ATP（过滤灭菌）。 　　2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。 操作步骤 一、 连接反应 　　1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管, 编号。 　　2、将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。 　　3、加蒸馏水至体积为8μl 4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24小时。 [注意] 1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。 　　 2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。 　　 3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。 4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。 　　5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。 * *