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多西紫杉醇对大肠癌细胞放射增敏的作用研究 　　[摘要] 目的 观察多西紫杉醇对大肠癌细胞株SW480的放射增敏作用及其机制。 方法 采用MTT法检测多西紫杉醇对SW480增殖的影响；克隆形成实验检测多西紫杉醇对SW480细胞的放射敏感性，并绘制存活曲线；流式细胞仪测定多西紫杉醇对SW480细胞周期的影响和细胞凋亡的变化。 结果 多西紫杉醇对SW480细胞株具有抑制增殖作用，随剂量增加和时间的延长而增强。多西紫杉醇+放疗组的SF2、D0、Dq较单纯放疗组均有所下降，多西紫杉醇的放射增益比（SER）为1.73。多西紫杉醇使SW480细胞发生G2/M期阻滞，并抑制S期的比例；与放疗联合时SW480细胞G2/M期阻滞更明显。多西紫杉醇增加放疗引起的细胞凋亡。 结论 多西紫杉醇能诱导肠癌细胞SW480凋亡增加，同时细胞周期再分布，从而增加其放射敏感性。 　　[关键词] 多西紫杉醇；大肠癌；放射增敏 　　[中图分类号] R735.34 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）12（a）-0010-04 　　在消化系统恶性肿瘤中，大肠癌最为常见。大肠癌患者的发病率及死亡率每年均呈增长趋势，如今在我国，大肠癌已成为恶性肿瘤病死原因的第2位。大肠癌确诊时大多已为晚期，术前放射治疗可以使肿瘤体积缩小，从而能降低直肠癌的临床分期及局部复发率，最终达到延长生存期的目的。近年来，放疗联合化疗药物使直肠癌疗效提高，患者受益，因而在局部晚期直肠癌中，新辅助治疗多选择放化疗联合[1]。多项研究已证实多西紫杉醇能提高非小细胞肺癌、宫颈癌、食管癌等细胞的放射敏感性[2-4]。本实验以多西紫衫醇联合放疗作用于大肠癌细胞，探讨多西紫衫醇对肠癌潜在可能的放射增敏作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 主要试剂 人肠癌细胞株SW480细胞购自上海生命科学研究院；多西紫杉醇（艾素）为江苏恒瑞医药股份有限公司生产；RMI-1640购自GIBCO BRL公司；AnnexinV-FITC/PI检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。 　　1.1.2 主要仪器 生物倒置显微镜，CO2培养箱，分光光度计，医科达医用直线加速器（瑞典），台式低速离心机，流式细胞仪。 　　1.2 方法 　　1.2.1 MTT法观察多西紫杉醇对SW480的增殖抑制作用 设对照组、空白组及多西紫杉醇作用组。SW480细胞培养到一定数量，96孔细胞培养板中每孔约5×103个细胞。加入不同浓度多西紫杉醇（0.1、0.5、1、3、5、10、20、40、60 μg/mL）培养液，每个浓度及组内设3复孔。继续培养24、48、72 h后，将96孔板进行MTT染色，测定OD值（λ=490 nm），计算抑制率。抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。以抑制率为纵轴，多西紫杉醇浓度为横轴，制作SW480细胞生长抑制曲线图。通过概率单位加权回归法（Bliss法）计算IC50。 　　1.2.2 克隆形成法检测多西紫杉醇对直肠癌SW480细胞的放射增敏作用 完全培养液3 mL于5%CO2，37℃培养箱中培养24 h，细胞贴壁后，进行分组处理：对照组；多西紫杉醇组：多西紫杉醇5 μg/mL（20% IC50）；放疗组：不同照射剂量（0、1、2、4、6、8 Gy） 照射；多西紫杉醇+放疗组：5 μg/mL多西紫杉醇处理细胞后2 h，再分别进行不同剂量（0、1、2、4、6、8 Gy）照射。每个浓度及组内设3复孔。处理结束后继续培养48 h，然后弃去含药物的培养液，换新鲜的不含药物的培养液，于培养箱内培养10～14 d。当6孔细胞培养板中出现肉眼可见的克隆的时候，经过洗涤、固定、染色，在低倍镜下计数大于50个细胞的克隆数，计算相关指标。公式：贴壁率（plating efficiency，PE）=对照组每孔克隆数/每孔细胞种植数×100%；存活率或存活分数（surviving fraction，SF）=实验组每孔克隆数/（每孔种植数×贴壁率）。以单击多靶数学模型拟合细胞存活曲线，计算出放疗组和放疗联合药物组的D0值，放射增敏效应以放射增敏比（SERD0）表示，定义为单独放疗组与放疗联合药物组的D0之比。 　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期分布 分组：对照组、放疗组、多西紫杉醇组和多西紫杉醇+放疗组。将细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，对照组更换无药培养液，多西紫杉醇组更换含有5 μg/mL多西紫杉醇的培养液，放疗组给以4 Gy剂量照射；多西紫杉醇+放疗组给予5 μg/mL多西紫杉醇同时接受4 Gy照射。组内设3复孔。继续培养48 h，收集细胞，洗涤、固定、PI染色后，记录激发波长488 nm处红色荧光。 　　1.2.4 Annexin