尼古丁对大鼠不同部位骨钙磷含量和碱性磷酸酶活性的差异影响.docVIP

尼古丁对大鼠不同部位骨钙磷含量和碱性磷酸酶活性的差异影响 　　[摘要] 目的 分析尼古丁对大鼠牙槽骨和颌骨内钙磷含量以及碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法 将20只5周龄健康雄性Wistar大鼠随机分为实验组和对照组，实验组每天腹腔注射尼古丁0.73 mg·kg-1，对照组腹腔注射等量生理盐水，3个月后处死取材。浓酸消化法检测牙槽骨和颌骨内钙磷含量，改良Reddi法检测牙槽骨和颌骨内ALP活性。采用SPSS 16.0统计软件分别行独立样本的t检验。结果 与对照组相比较，实验组牙槽骨内和颌骨内钙磷含量均明显减少，差异均有统计学意义（P0.05）。实验组中牙槽骨与颌骨比较，骨钙磷含量和ALP活性差异无统计学意义（P0.05）。结论 尼古丁下调大鼠牙槽骨和颌骨内钙磷含量，对ALP活性的影响不明显。 　　[关键词] 尼古丁； 牙槽骨； 颌骨； 钙； 磷； 碱性磷酸酶 　　[中图分类号] R 781.4 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.002 　　流行病学研究显示：吸烟与牙周炎的普遍性、严重性及骨丧失关系密切；对牙周治疗有负面影响，常影响牙周治疗的效果。吸烟者牙周炎的临床体征明显有别于非吸烟者，如牙周探诊出血少、牙周袋深、牙槽骨丧失严重等[1-2]。 　　尼古丁作为烟草中的主要生物碱，能促进机体释放神经传导物质，限制抗体的产生，影响外周免疫调节T细胞；减少机体对钙的吸收从而导致骨质疏松，影响成骨和骨的矿化[3]。体外研究[4]发现尼古丁通过抑制成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和Ⅰ型胶原纤维（collagen type Ⅰ，COL1）的分泌从而抑制骨形成及矿化。但关于 　　尼古丁对骨形成和改建影响的体内研究尚缺乏相关报道，其机制尚不清楚。 　　骨形成过程包括成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。生物矿化则是指细胞合成和分泌有机基质后，钙和磷酸根不断沉积其中，当达到饱和度时，在基质上与非胶原蛋白结合形成磷酸钙晶核，晶核长大为晶体，与基质一起组成结构有序的矿化组织。矿化组织中的无机物主要是钙和磷，ALP在矿化组织细胞如成 　　骨细胞中高表达，是生物矿化的重要标记[5-7]。本实验拟通过定量检测腹腔注射尼古丁动物模型不同部位骨内的钙磷含量以及ALP活性的差异，初步探讨尼古丁对骨矿化的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 药物、试剂和仪器 　　尼古丁（北京伊普瑞斯科技有限公司），对硝基苯磷酸二钠（disodium 4-nitrophenyl phosphate，PNPP） 　　（Sigma公司，美国），电感耦合等离子体发射光谱仪（热电公司，美国），微波消解仪（型号MARS-5，培安公司，美国），电热恒温鼓风干燥箱（天津市中环 　　实验电炉有限公司），电子天平（型号AB204-s，梅特 　　勒公司，瑞士）。 　　1.2 动物的选择、分组和建模 　　选取由哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心提供的5周龄健康雄性Wistar大鼠20只为研究对象，体重为120～140 g。随机分为实验组和对照组，实验组每天腹腔注射尼古丁0.73 mg·kg-1，对照组腹腔注射等量生理盐水，常规饲养。 　　1.3 取材和组织生物化学检测 　　建模3个月后取材。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，在碎冰上解剖大鼠下颌骨后，除净附着的软组织，剪除切牙部分，获取下颌切牙区牙槽骨，同时剪取下颌支部分，分别用湿纱布包裹后，置于-80 ℃冰箱保存。 　　1.3.1 骨钙骨磷的测定 自-80 ℃冰箱取出大鼠左侧下颌牙槽骨和颌骨标本分别称湿重，利用阿基米德原理测定样本的体积，电热恒温箱烘干至恒重后进行以下测定。1）骨干重测定：电子天平称量，精确到0.000 1 g；2）骨矿物质测定：取钙标准溶液配 　　制成10、50、100、200、500×10-6的标准系列；取磷标准溶液配制成5、25、50、100、250×10-6的标准系列。每个样本分别置于消化罐中并加入1 mL去离子水、2 mL 30%过氧化氢、5 mL浓硝酸，同时设置空白对照，密闭后置微波消解仪中消化2 h，样本最后定容至25 mL，借用电感耦合等离子体发射光谱仪，光谱系为178.2条件下测定骨钙骨磷含量，求单位体积的骨钙骨磷含量。 　　1.3.2 ALP测定 自-80 ℃冰箱取出大鼠右侧下颌牙槽骨和颌骨样本分别称湿重，用改良Reddi法[8]，至匀浆机内加入冰预冷的生理盐水2 mL匀浆，10 000 r·min-1离心10 min。取上清液100 μL，加入1 mmol·L-1 PNPP 50 μL，37 ℃孵育15 min，加1 mol·L-1 NaOH 5