RNA干扰瞬时受体电位阳离子通道1表达抑制缺氧诱导的胶质瘤血管内皮生长因子上调的实验研究.docVIP

RNA干扰瞬时受体电位阳离子通道1表达抑制缺氧诱导的胶质瘤血管内皮生长因子上调的实验研究 　　[摘要] 目的 探讨瞬时受体电位阳离子通道1（TRPC1）是否参与缺氧诱导的胶质瘤细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达。 方法 通过RT-PCR和钙图检测技术观察U87细胞上表达的TRPC亚型；采用RNAi技术、real-time RT-PCR、免疫印迹和ELISA方法，在基因和外分泌蛋白水平观察TRPC1对缺氧U87细胞VEGF表达的影响。 结果 U87胶质瘤细胞表达TRPC1，TRPC3，TRPC4和TRPC5亚型。TRPC通道激动剂OAG增加了胞内Ca2+浓度，而TRPC通道阻断剂2-APB可抑制激动剂诱导的胞内Ca2+浓度增加。化学合成的siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3分别减少TRPC1 mRNA到64%，39%和36%（P 0.01）；分别减少TRPC1蛋白到48%，29%和33%（P 0.01）。siRNA-2和siRNA-3显著抑制了缺氧诱导的VEGF基因上调（P 0.01）。同时缺氧U87细胞VEGF蛋白的分泌亦受到抑制（P 0.01）。 结论 U87胶质瘤细胞表达功能性的TRPC通道，TRPC1参与缺氧诱导的胶质瘤VEGF表达。 　　[关键词] 神经胶质瘤；缺氧；瞬时受体电位阳离子通道1；血管内皮生长因子 　　[中图分类号] Q291 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（a）-0004-04 　　神经胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤。低恶性的胶质瘤转化为恶性多形性神经胶质瘤（glioblastoma multiforme，GBM）时，肿瘤出现显著的血管化[1]。大量的血管生成是肿瘤恶性生长的先兆，同时导致大部分患者中位生存时间将不超过50周。抑制GBM的血管生成，对于患者的预后具有重要意义。低氧是引起实体瘤血管生成的重要因素。研究证实，低氧通过激活缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF1），促进血管内皮生长因子（vascular endothelia growth factors，VEGF）的表达与释放，从而导致血管生成[2]。 　　缺氧诱发的胞内钙信号亦参与缺氧反应，如缺氧基因表达。瞬时受体电位阳离子通道（transient receptor potential channels，TRPC）是一类通透Ca2+和Na+的非选择性阳离子通道[3]。近年来研究发现，TRPC通道能感受包括低氧在内的多样性外界刺激[4]。人类细胞表达6个TRPC亚型（TRPC1～TRPC7），除了TRPC2（假基因）。其中，TRPC1广泛表达于多种组织，包括大脑、心脏、平滑肌、内皮、肝脏和睾丸等，发挥重要的生理功能。同时，所有其他TRPC亚型都可和TRPC1组成异源多聚体协同作用[5]。因此，TRPC1通道在TRPC亚型中占有重要地位。研究发现，TRPC1介导了缺氧诱导的肺动脉内皮及平滑肌细胞的增殖[6-7]。然而，TRPC1通道是否参与缺氧反应基因-VEGF的表达，尚不清楚。本研究拟通过RNAi技术探讨TRPC1对缺氧细胞VEGF表达的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞培养 　　人类恶性胶质瘤细胞U87（ATCC）培养于CO2培养箱，常氧条件为21% O2，5% CO2。培养基为DMEM培养基添加10%胎牛血清（invitrogen）。细胞生长至70%～80%时进行传代或接种进行实验。 　　1.2 缺氧处理 　　U87细胞接种36 h后更换为低氧培养基。新鲜培养基于缺氧环境（5% CO2，1% O2，94% N2）预先孵育16～24 h，以造成低氧培养基（氧分压约为43 mm Hg，1 mm Hg=0.133 kPa）。然后迅速放入三气培养箱（forma scientific），环境条件为：5% CO2，1% O2，94% N2，培养至相应时间。 　　1.3 RT-PCR 　　使用Trizol（invitrogen）提取细胞总RNA。运用Oligo 6.0 设计引物，所有引物均跨越两个不同的外显子以避免基因组DNA污染，序列见表1。 　　总RNA反转录产物进行定量PCR扩增（real-time RT-PCR）（SYBR Premix Ex Taq kit，Takara）。扩增条件如下：95℃ 10 s；PCR循环参数：95℃ 15 s，VEGF（59℃）；TRPC1：53℃ 15 s，72℃ 15 s；80℃ 5 s采集荧光，共40个循环。溶解曲线参数：95℃ 60 s，72℃ 30 s，95℃ 30 s，溶解曲线测定全程每隔0.2 s采集SYBR荧光。使用Livak等[8]改良的方法，进行基于内部参照β