姜黄素与紫杉醇联用对人子宫内膜癌细胞增殖的影响及其机制研究.docVIP

姜黄素与紫杉醇联用对人子宫内膜癌细胞增殖的影响及其机制研究 　　[摘要] 目的 探讨姜黄素（CCM）与紫杉醇（PIX）联用对人子宫内膜癌细胞（Ishikawa）增殖的影响及其机制。 方法 （1）设置对照组（不加药物）、CCM组（不同浓度的CCM）、PIX组、联合组（PIX联合不同浓度的CCM）；（2）采用MTT法检测不同浓度的CCM联合PIX对细胞活力的影响；（3）流式细胞术检测细胞凋亡率；（4）免疫组化法检测Caspase-3蛋白表达情况。 结果 CCM联用PIX能抑制人子宫内膜癌细胞的增殖（P 0.05），且随CCM浓度的增加，抑瘤作用增加；两种药物均可诱导细胞凋亡，且各组凋亡率与药物浓度呈正相关（P 0.05）；免疫组化结果显示随着染毒浓度的增加和联合作用，Caspase-3蛋白的表达升高（P 0.05）。两药联用抗瘤作用增强。 结论 CCM、PIX均可抑制人子宫内膜癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡、上调细胞Caspase-3表达，呈剂量依赖性，且两者联用具有协同作用。 　　[关键词] 姜黄素；紫杉醇；Caspase-3；子宫内膜癌；增殖；凋亡 　　[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）06（b）-0021-03 　　姜黄素（curcumin，CCM）是从姜科植物姜黄中提取的一种酚性化合物，毒性低，耐受性好，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎[1-2]、抑制血管增生、降血脂[3-5]等多种药理作用。近几年的研究表明，姜黄素具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用。紫杉醇（paclitaxel，PIX）是子宫内膜癌的常规化疗用药，但由于药物毒性及耐药性使其实际疗效与人们期望的相差很大。本实验主要研究CCM与PIX联用对人子宫内膜癌细胞株增殖的影响及其机制，探讨其是否有协同作用，为CCM应用于临床提供基础理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　人子宫内膜癌细胞株（Ishikawa）（上海复祥生物科技公司）；姜黄素（Sigma公司）；紫杉醇（哈药集团）；兔抗人Caspase-3多克隆抗体、Sp Rabbit HRP Kit（羊抗兔）（北京康为世纪公司）；AnnexinV-FITC试剂盒（凯基公司）；胎牛血清（四季青）；RPMI-1640培养液、0.05%胰蛋白酶、MTT细胞增殖试剂盒、二甲基亚砜（DMSO）等试剂。姜黄素用DMSO溶解为25 mmol/L，4℃冰箱保存，用时稀释到工作浓度。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 　　将人子宫内膜癌细胞接种于培养瓶中，培养基为含10%新生小牛血清的RPMI-1640，置37℃，5%CO2培养箱培养，待细胞长满培养瓶80%～90%时，0.05%胰蛋白酶消化。 　　1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率 　　1.2.2.1 CCM对Ishikawa细胞增殖的影响 用0.05%胰蛋白酶消化对数生长期的Ishikawa细胞后，加入培养基终止消化，调整细胞数为3×104个/mL，各取100 μL细胞悬液接种于96孔培养板，放入培养箱中培养24 h，弃上清，加入含不同浓度CCM的培养基，使其终浓度为3.33、6.67、16.67、33.33、66.67 μmol/L，每个浓度设5个复孔。同时设空白对照孔（仅含培养基）、对照孔（细胞、培养基）。继续培养48 h后，每孔加入5 g/L的 MTT溶液10 μL，继续培养4 h后，每孔加入100 μL的Formanzan溶解液，置摇床上低速振荡30 min。在490 nm的波长下测定各孔吸光度值（OD值）。细胞生长抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。 　　1.2.2.2 PIX联用不同浓度CCM对Ishikawa细胞增殖的影响 处理同上，设对照组、CCM组（不同浓度CCM）、PIX组（50 μg/mL）、联合组（PIX 50 μg/mL联合不同浓度的CCM）。在490 nm的波长下测定各孔吸光值。联合用药对细胞增殖抑制率按下式推测[6]：q=E（AB）/[EA+（1-EA）×EB]。其中E（AB）为两药合用的抑制率，EA和EB为两药单用的抑制率，q=0.85～1.15表明两药作用相加；q1.15表明两药作用协同；q0.85表明两药相互拮抗。 　　1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 　　取单细胞悬液接种于6孔板中培养后，加药物。设对照组、CCM组（3.33、6.67、16.67 μmol/L）、PIX组（6 μg/mL）、联合组（PIX 6 μg/mL联合CCM 3.33 μmol/L），继续培养24 h后去废液，PBS洗涤，离心收集细胞，PBS洗涤，调整细胞浓度5×105个/mL，加入200 μL Binding