藏红花素诱导人脑胶质瘤细胞U87凋亡的作用机制研究.docVIP

藏红花素诱导人脑胶质瘤细胞U87凋亡的作用机制研究 　　[摘要] 目的 探讨藏红花素促进人脑胶质瘤细胞U87凋亡的作用及其机制。 方法 培养U87细胞系，随机分为二甲基亚砜对照组（对照组）和藏红花素治疗组（藏红花素组）。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同剂量藏红花素（低浓度组、中浓度组、高浓度组）对人胶质瘤细胞U87增殖的影响；流式细胞仪观察细胞凋亡情况。Western-blot检测ERK1/2，p-ERK1/2的表达变化。 结果 与对照组比较，藏红花素组U87细胞的生存率明显降低；随着藏红花素浓度增加，U87细胞的凋亡率显著上升（18.92%→51.68%→70.12%），组间差异有统计学意义（χ2=14.102，P 0.05）；Western-blot结果显示，与对照组比较，藏红花素组的p-ERK1/2表达降低，而高浓度藏红花素组p-ERK1/2表达降低最显著，不同组间差异有统计学意义（P 0.05）。 结论 藏红花素可能呈剂量依赖性的通过抑制p-ERK1/2促进U87细胞凋亡，发挥重要的抗肿瘤作用。 　　[关键词] 藏红花素；U87胶质瘤细胞；凋亡；剂量依赖性；p-ERK1/2 　　[中图分类号] R739.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（c）-0011-03 　　藏红花（Crocus Sativas）是一种鸢尾科番红花属的多年生花卉，藏红花素（Crocin）是藏红花中提取的一种化学成分，是一种不常见的水溶性类胡萝卜素（二羧酸多烯单糖酯）[1]。药理学研究表明藏红花素不仅能够提高免疫功能，而且对肺癌、宫颈癌和胃癌等多种肿瘤细胞有明显的抑制作用，且毒副作用小，其抗癌机制可能与诱导细胞凋亡有关[2-4]。为进一步研究藏红花素对人脑胶质瘤的抑制作用及其机制，本文在培养人脑胶质瘤细胞U87的基础上，深入探讨了藏红花素诱导肿瘤凋亡的作用和具体分子机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　藏红花素、DMEM培养液、四甲基氮唑蓝（MTT）、青霉素、链霉素、Fluo-3AM均购自Sigma公司；U87购自美国ATCC；胰蛋白酶、胎牛血清均购自北京鼎国生物技术公司。兔抗人ERK1/2，p-ERK1/2单抗，山羊抗兔二抗购自美国Santa ctruz公司。空气净化台购至苏州净化设备厂，酶联仪器购至美国伯乐公司。 　　1.2 细胞培养 　　以干粉培养基溶解法制备DMEM培养液，并按要求调节pH后，用无菌滤膜过滤除菌后冻存。细胞培养时取出冻存DMEM培养液，加入10%胎牛血清、0.37%NaHCO3、0.42%HEPES、100 U/mL青霉素/链霉素制成DMEM细胞培养液，充分溶解后将U87脑胶质瘤细胞接种于培养液，然后置入5%CO2孵箱中培养，设置培养温度为37℃；采用酶消化法传代培养，消化液为0.25%胰蛋白酶、0.02%的EDTA。培养成熟的U87细胞随机分为二甲基亚砜对照组（对照组）、低剂量藏红花素处理组（低浓度组）、中剂量藏红花素处理组（中浓度组）和高剂量藏红花素处理组（高浓度组），共4组，每组重复6次。 　　1.3 细胞活力检测 　　细胞活力检测采用MTT法，选择处于对数生长期的U87细胞，分别对细胞进行计数，并配置密度为2×104/mL的细胞悬液，然后接种于含有96孔的培养板内，将所有培养孔分组，分别加入不同浓度的藏红花素（浓度分别为0、1、2.5、5 mg/mL），以加入DMEM培养液为对照；加液完成后培养板放入5%CO2孵箱中培养，设置培养温度为37℃，培养时间为24、48、72 h，实验结束前4 h每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL继续培养4 h，2000 r/min离心吸弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO）终止反应，震荡10 min。酶标分析仪检测490 nm波长的光密度值。抑制率（%）= （A对照组-A实验组）/A对照组×100%。 　　1.4 流式细胞术（FCM）检测凋亡细胞 　　取4个100 mL的培养瓶，均行U87细胞接种，均培养24 h，然后将培养液换成含藏红花素的培养液，继续培养24 h。培养后使用消化酶除壁后加入含血清的完全培养基，培养到时间后，轻微吹打使细胞脱壁，将含培养细胞的培养液按500 r/min离心5 min收集细胞，吸弃上清，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次。然后按照Annexin V FITC试剂盒说明书进行操作，用FCM定量分析细胞凋亡水平。 　　1.5 Western-blot法检测ERK1/2，p-ERK1/2表达 　　按照每泳道40 μg蛋白含量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结束后半干法转移蛋白至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入ERK1/2，p-ERK1