基因在大肠杆菌中的表达基因工程主要目标之一是生产常规方法难以.ppt

基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。 最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。 一 真核基因在原核细胞中表达的特点 大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。 ④易培养，成本低。 大肠杆菌表达载体的成份 ⑴启动子 要求是：①强启动子②是诱导性的，如热诱导和化学诱导。 启动子的结构对表达效率的影响 大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10bp，故称为-10区，序列为5’--TATAAT)和-35区(位于转录起始位点上游25bp处，一般有10bp组成， 5’-- TTGACA故称为-35区，)。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性就越强。 ⑵转录终止子: 使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。 尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。 真核基因在大肠杆菌中的表达 融合蛋白的表达 非融合蛋白的表达 蛋白分泌型表达 蛋白质的融合表达 融合蛋白配偶体：融合蛋白中与目标蛋白相连的其他蛋白组分 葡萄球菌蛋白A（SPA），硫氧还蛋白（TRX），谷胱甘肽-S-转移酶（GST） HIS标签 作用：阻止包涵体的形成，改善蛋白质的折叠功能，限制蛋白质的酶解活性，易于分离纯化 蛋白质的分泌型表达 将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现分泌表达。 实现蛋白质分泌表达有许多有利之处： 1.在穿膜过程中信号肽被信号肽酶切除。生产的蛋白质和天然蛋白质是一致的。 2. 分泌的蛋白稳定。 3. 使得重组蛋白易纯化。 4. 有利于二硫键的正确形成。 表达产物的鉴定 SDS凝胶电泳 WESTERN BLOT 生物活性检测 第九节基因在酵母中的高效表达 大肠杆菌表达系统的缺陷： 1.缺失真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等。 2.表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和生物活性。 因此，可以使用真核生物酵母作为表达菌。如酿酒酵母、甲醇酵母等。 酵母表达系统的优点 作为一种单细胞生物在操作和生产上方便 具有翻译后加工系统 形成二硫键 糖基化 去除起始甲硫氨酸 * 欢 迎 基因在大肠杆菌中的表达 据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 原核体系中表达真核基因的困难 细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子； 真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上； 真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白； 表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。 5. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在； ⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。 ⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。 ⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。 构建表达载体的策略 启动子（promoter）：在基因序列中，标志着转录起始的可被RNA聚合酶识别的位点(DNA区段)，一般位于基因的上游。