实验14细胞免疫功能测定.ppt.pptVIP

实验十四 细胞免疫功能测定 一、实验目的和要求 1、熟悉非特异性免疫细胞功能的测定方法 2、了解特异性免疫细胞的测定方法 （二）实验内容1、吞噬细胞吞噬功能测定 （1）吞噬细胞吞噬功能测定原理 具有吞噬功能的细胞称为吞噬细胞，包括小吞噬细胞和大吞噬细胞二类。小吞噬细胞一般指血液中的中性粒细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞。 病原微生物、红细胞等异物侵入机体或在体外与吞噬细胞接触，吞噬细胞即进行吞噬。取细胞作涂片，镜检计算吞噬百分率和吞噬指数，可估计吞噬细胞的吞噬功能。吞噬细胞（巨噬细胞）在体液免疫和细胞免疫中均起着重要作用，吞噬细胞（巨噬细胞）与抗肿瘤免疫也有重要的关系。因此，测定吞噬细胞的吞噬和消化功能，可在一定程度上反映机体的免疫状态，也可作为判断疗效的指标之一。 （2）实验动物与试剂 实验动物：小白鼠 实验试剂：无菌生理盐水、5%无菌可溶性淀粉溶液、白色葡萄球菌培养物、瑞氏染液 实验器材：无菌注射器、吸管、载玻片、解剖器械、显微镜等。 1、试验前3天，小鼠腹腔注射5%无菌可溶性淀粉溶液1ml。 2、试验当天，小鼠腹腔注射1mL白色葡萄球菌悬液。 3、注射后30min，断颈处死小鼠，仰位固定小鼠，正中剪开腹部皮肤，吸出腹腔液制定涂片，自然干燥后瑞氏染液染色。 4、瑞氏染液染色：在涂片上滴3~5滴瑞氏甲液，30~60sec后,滴加瑞氏乙液,并用洗耳球吹数下,将乙液与甲液充分混均,5~10min后,水洗,干燥,镜检. 5、镜检：低倍对光，用油镜下观察吞噬细胞吞噬细菌的情况。 　 涂片制作过程 瑞氏染色 （四）实验结果 绘 图 2、吞噬细胞吞噬功能的测定 结果记录 （1）吞噬百分率：观察100个吞噬细胞，计数被吞噬百分率以表示吞噬细胞的吞噬功能。 （2）吞噬指数：观察100个中性粒细胞，计数被吞噬的细菌总数，平均每个中性粒细咆吞噬的细菌数即为吞噬指数。 2、特异免疫细胞功能测定 （1）T淋巴细胞数量测定 （2）T淋巴细胞功能测定 （1）T淋巴细胞数量测定——E花环试验 原 理 人类T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞（SRBC）受体， SRBC能粘附于T细胞周围，形成玫瑰花环样的细胞团，称为E花环，形成E花环的细胞也称为红细胞花环形成细胞（ERFC）。通过花环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。 二种类型的E花环 1、短时间形成的玫瑰花环，称活性玫瑰花环（Ea-RFC）。 Ea-RFC代表着某些T细胞的亚群，更能敏锐地反映出细胞免疫的功能状态。 2、在4℃下较长时间作用形成的玫瑰花结，是由全部T细胞与SRBC结合形成的，称总玫瑰花环（ET-RFC）。 实验方法 （1）淋巴细胞的分离； （2）淋巴细胞与SRBC的计数； （3）按淋巴细胞与SRBC 1：60的比例混匀，置 4℃作用2小时； （4）离心，取沉淀涂片，染色镜检。 3、结 果 高倍镜下计数200个淋巴细胞，算出E花环阳性细胞百分率。 （2） 淋巴细胞转化试验（LTT） 原 理 将体外培养的T淋巴细胞用非特异性的有丝分裂原如PHA、ConA等刺激，使之转化为淋巴母细胞。淋巴母细胞体积较T淋巴细胞大，其中胞浆丰富，DNA和RNA合成增加，细胞可发生核分裂。T淋巴细胞的转化能力可反映机体的细胞免疫功能。 方法 取抗凝血加入到细胞培养液中； 培养液中加PHA，置37 ℃温箱培养72小时； 离心、涂片、固定、染色、镜检 结 果 在油镜下观察淋巴细胞转化情况，计数200个淋巴细胞，计数其中转化淋巴细胞（含过渡型）的百分率，即淋巴细胞转化率。 转化型细胞数 淋巴细胞转化率= * * （3）实验方法 1、滴3-5滴瑞氏甲液，覆盖整个血膜,染30-60sec后, 2、滴加等量瑞氏乙液,并用洗耳球吹数下,将乙液与甲液充分混均,5-10min后, 3、平放玻片，流水从玻片一侧冲去染液,自然干燥,镜检 如染色结果正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而白细胞浆则为淡红色。 1、吞噬细胞吞噬现象镜下观 吞噬百分率 = 吞噬细菌的细胞数 —————————— 100个吞噬细胞 X100% 吞噬指数 = 100吞噬细胞吞噬细菌的总数 ————————————— 100个吞噬细胞 X100% SRBC T淋巴细胞 正常值：ET-RFC为 50%-80% 转化型细胞数+未转化型细胞数 ×100% 正常值：淋巴细胞转化率为60%~80%