实验四大肠菌群的生理生化特性试验.docVIP

实验四 大肠菌群的生理生化特性试验 一、实验目的和要求 学习测定大肠杆菌培养基的制备，掌握大肠杆菌生理生化特性的测定方法，掌握大肠杆菌计数的方法。实验学时 4小时 二、实验设备与仪器 水样瓶、吸管、试管、锥形瓶、稀释瓶、培养皿(平皿)、发酵管和发酵瓶。发酵管有大小之别，小发酵管可用15mm×150mm的试管，大发酵管须有200mL以上的容量、显微镜、电冰箱、普通放大镜，pH，接种环、高压蒸汽灭菌器、恒温箱(培养箱)、电冰箱、镜油(香柏油)、二甲苯、擦镜纸等。乳糖蛋白胨培养基、 浓乳糖蛋白胨培养基、品红亚硫酸纳培养基（甲）、伊红美蓝培养基、革兰氏染色剂、待测水样。 上述各种培养基及染色剂的成分与配制方法如下： (一)乳糖蛋白胨培养基 1．成分 蛋白胨 10 g 牛肉膏 3 g 乳糖 5 g 氯化钠 5 g 1.6溴甲酚紫乙醇溶液 1 mL 蒸馏水 1000 mL 2．制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000 mL蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4。 加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1 mL，充分混匀，分装于小发酵管（内有倒管）中，每管装10mL。 (3)置高压蒸汽灭菌115℃（0.7 kg/cm2）灭菌20 min。 (4)贮存于冷暗处备用。 (二) 浓乳糖蛋白胨培养基 按上述“乳糖蛋白胨培养基”浓缩3倍配制。分装于发酵瓶或发酵管（内有倒管）中，每个发酵瓶或大发酵管装50mL，每个小发酵管装5mL。 (三) 品红亚硫酸钠培养基(甲) 1．成分 蛋白胨 10 g 乳糖 10 g 磷酸氢二钾 3.5 g 琼脂 20-30 g 蒸馏水 1000 mL 无水亚硫酸钠 5 g左右 5碱性品红乙醇溶液 20 mL 2．储备培养基的制备 (1)先将琼脂加至900 mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使溶解，再以蒸馏水补足至1000 mL，调整pH为7.2~7.4。 (2)趁热用脱脂棉或纱布过滤(最好用保温漏斗)，再加入乳糖，混匀后定量分装于锥形瓶内，置高压蒸汽灭菌器中以115℃（0.7 kg/cm2）灭菌20 min，贮存于冷暗处备用。 3．平板的制备 (1)将上法制备的储备培养基加热融化。 (2)根据锥形瓶内培养基的量，用无菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于无菌空试管中。 (3)根据锥形瓶内培养基的量，按比例称取所需的无水亚硫酸纳置于无菌空试管内，加无菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10 min以灭菌。 (4)用无菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液中至深红色褪成淡粉红色为止。 (5)将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加于已融化的储备培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)。 (6)立即将此种培养基适量倾入己灭菌的培养皿内(90 mm直径的培养皿约需培养基10-15 mL)，待其冷却凝固后置冰箱内备用。此种己制成的培养基于冰箱内保存亦不宜超过二周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。 四伊红美蓝培养基： 1．成分 蛋白陈 10 g 乳糖 10 g 磷酸氢二钾 2 g 琼脂 20-30 g 蒸馏水 1000 mL 2%伊红水溶液 20 mL 0.5%美蓝水溶液 13 mL 2．储备培养基的制备 (1)先将琼脂加入900 mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使溶解，再以蒸馏水补足至1000 mL，调整pH为7.2-7.4。 (2)趁热用脱脂棉或纱布过滤(最好用保温漏斗)，再加入乳糖，混匀后定量分装于锥形瓶中，置高压蒸汽灭菌器内以115℃ (0.7kg/cm2)灭菌20 min。贮存于冷暗处备用。 3．平板的制备 (1)将上法制备的储备培养基加热融化。 (2)根据锥形瓶内培养基的量，用无菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液加入已融化的储备培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)。 (3)立即将此种培养基适量倾入已灭菌的培养皿内(对于90 mm直径的培养皿10-15 mL)，待其冷却凝固后，置冰箱内备用。 三、实验前准备工作 1. 预习实验指导书实验四的内容。 2. 制备好本次实验分离用的培养基和无菌水、无菌器皿。 四、实验注意事项 1. 实验中使用高压