Q10 第十章 聚合酶链式反应技术20161013.ppt

设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。 引物设计现在多用专业软件 ⑧套嵌引物（nested primers) 1 3 2 4 如Primer6.0等 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性分解 dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性 （3） dNTP （4）模板DNA 但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 ② 模板的量： 不能太多，100?l反应体系中100ng足够。 ① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高。 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 （5） Mg2+ PCR反应条件优化 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（PCR效率及产物量） 1、温度 变性温度：94-97 ℃ 退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右，一般55-60℃ 温度过高：降低扩增效率； 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72 ℃，此时Taq酶具有较高的酶促活性 2、时间 第一次变性应给予足够时间（5-7分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为 复性时间：30～60sec 延伸时间：1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min 3-4Kb的DNA片段，延伸时间3-4min 10Kb的DNA片段，延伸时间15min 3、循环次数 重复次数一般设为25～35个循环 扩增反应的平台效应： 理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长 PCR反应曲线 PCR 产物分析Analysis of PCR products Gel analysis (琼脂糖凝胶电泳/聚丙烯酰胺凝胶电泳 ) : PCR 产物电泳，EB（溴乙锭）染色， 紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。 Restriction-endonuclease digestion analysis： 酶切、电泳分离。 产物的鉴定，基因分型，研究变异性。 Hybridization ： (Southern blot/dot blot ) electrophoresis/hybridization Sequence analysis：是检测PCR产物特异性的 最可靠方法。 常用PCR技术 原位PCR (in situ PCR) 多重PCR（multiplex PCR） 长距离PCR (Long-range PCR) 逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） 荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR） 巢式PCR（nesting PCR）-4条引物 原位ＰＣＲ （In situ PCR） 原位聚合酶链式反应（In situ PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 原位PCR的作用 利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。 多重PCR（Multiplex PCR 复合PCR） 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 1 2 3 4 1 2 3 4 RT-PCR（reverse transcription-PCR） Temin,H.发现反转录酶， 1975诺贝尔奖 技术关键： 利用逆转录酶，把mRNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 RNA template 3’ 5’ 下游引物 cDNA first strand 3’ 5’ 上游引物 cDNA first strand cDNA second strand 3’ 5’ 3’