纤维素酶辅助提取黄花蒿中青蒿素的工艺条件研究.docVIP

纤维素酶辅助提取黄花蒿中青蒿素的工艺条件研究 　　[摘要] 目的 研究纤维素酶辅助提取青蒿素反应中各条件对提取率的影响。 方法 采用紫外分光光度法测定青蒿素含量，研究酶反应过程中时间、加酶量、温度和pH值对提取率的影响，并使用正交实验方法对提取工艺进行优化。 结果 纤维素酶辅助提取青蒿素的最优工艺条件分别是：酶反应时间2 h，纤维素酶用量0.30 g，酶反应温度45℃，酶反应pH值4.5。 结论 纤维素酶辅助提取青蒿素的方法能够有效提高提取率。 　　[关键词] 青蒿素；纤维素酶；提取 　　[中图分类号] R965.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（c）-0014-03 　　青蒿素（artemisinin，C15H22O5）是治疗疟疾的特效药，具有速效、高效和低毒等抗疟性能[1]。目前，青蒿素主要从黄花蒿（Artemisia annua L.）中提取[2]。近年来，用于天然产物提取的新技术如微波技术、酶技术等迅速涌现，并取得显著的成效[3]。酶技术具有反应效率高、条件温和、专一性强和有效成分破坏少等优点[4]，受到广泛关注。 　　我国是黄花蒿的主产国，将酶技术应用于青蒿素的提取过程，对提高提取效率、充分利用资源有重要意义。本研究对纤维素酶辅助提取青蒿素的条件进行研究，分析各因素对提取率的影响，并采用正交实验的方法对酶辅助提取工艺进行优化，为纤维素酶在青蒿素提取工艺中的应用提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1 材料 　　青蒿药材购于广州市清平中药材市场（生产批号120711），经鉴定为菊科植物黄花蒿的干燥地上部分，药材经粉碎后过40目筛备用。纤维素酶Cellulase T4（来源于绿色木霉Trichoderma viride，生产批购自天野酶制剂（上海）有限公司。青蒿素标准品（生产批号A2118）购自百灵威科技有限公司，无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂公司。 　　1.2 仪器设备 　　FW135型中药粉碎机，SHA-2型恒温水浴振荡器，HH-4型恒温水浴锅，752型紫外可见分光光度计，SHZ-D型循环水真空泵。 　　1.3 方法 　　1.3.1纤维素酶辅助提取青蒿素的方法 　　称取1 g粉碎后的青蒿样品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液，先常温下浸泡10 min，再加入一定量的纤维素酶，然后在一定温度下水浴振荡进行酶反应。酶反应结束后，抽滤，将滤饼置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml 无水乙醇，在45℃下水浴振荡1 h，抽滤，取滤液测定青蒿素含量。 　　1.3.2青蒿素含量的测定方法 　　青蒿素仅在紫外区203 nm处有较弱的末端吸收，但与碱反应后，生成一化合物Q292，该物质在292 nm处有最大吸收，可用紫外分光光度法检测[5]。取样品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组测定3个平行样品，取平均值。根据标准曲线换算出青蒿素含量。 　　2结果 　　2.1青蒿素含量测定的标准曲线 　　精确称取青蒿素标准样品10 mg，溶于95%的乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的标准溶液。分别取标准溶液0、1、2、3、4、5 ml，加95%的乙醇溶液至5 ml，再加入0.2%NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组取3个平行样品，取平均值。以青蒿素样品浓度x（g/L）为横坐标，292 nm吸光值y为纵坐标作图，结果见图1。在292 nm下，青蒿素浓度在0～1 g/L的范围内，与吸光值呈良好的线性关系，表明测定方法准确可靠。 　　2.2 不同酶反应时间对青蒿素提取的影响 　　按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶，在45℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值为4.5，反应时间分别为1、2、3、4、5 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果见图2。随着时间的延长，青蒿素的提取率逐渐增加，在3 h左右达到最大值，再延长提取酶反应的时间，青蒿素的提取率基本不变。 　　2.3 不同加酶量对青蒿素提取的影响 　　按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中分别加入0.1、0.2、0.3、0.4g纤维素酶，在45℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值为4.5，反应时间1 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青