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小鼠生精相关基因Vad1.2表达载体的构建及鉴定 　　摘 要：目的：构建小鼠生精相关基因Vad1.2表达载体并进行鉴定。方法： 将小鼠睾丸组织中Vad1.2转录本进行RT-PCR扩增，通过DNA重组技术将其插入克隆载体pET15b中，将表达载体转化入大肠杆菌BL21（DE3）RIL感受态细胞，提取重组质粒并通过酶切及DNA测序进行鉴定。结果：随机挑取的克隆经双酶切鉴定，证实Vad1.2表达载体构建成功，插入基因序列正确。结论： 成功构建了小鼠Vad1.2基因表达载体，为Vad1.2基因的进一步研究奠定了实验基础。 　　关键词：精子发生；Vad1.2；小鼠 　　Abstract：Objective： To construct and characterize the Vad1.2 expression vector related to spermatogenesis in mice. Methods： Vad1.2 transcript was amplified from mouse testis by RT-PCR. The amplified product was inserted into pET15b vector. Then the Vad1.2 over-expression vector was transformed into E. coli BL21 （DE3） RIL competent cells and identified by endonuclease digestion and DNA sequencing. Results： Putative positive clones were verified by double restriction digestion， displaying the pET-15b vector backbone and the insert with correct size. Conclusion： The Vad1.2 over expression vector has been successfully constructed， which is of significance for the functional study of Vad1.2 gene in spermatogenesis. 　　Key words： spermatogenesis； Vad1.2； mice 　　目前我国育龄夫妇中不孕不育的发病率约为10-15%，其中约有30-50%与男性因素有关。除女性不孕因素外，这些男性患者大都属于病因不明的特发性不育，这对于不育症的治疗是极其不利的。对于这些男性患者，基因水平的异常很可能是大部分特发性不育的主要病因[1]。Vad1.2基因是近年来在维生素A缺乏的动物模型研究中发现的与精子发生相关的特异性基因。小鼠Vad1.2基因由5个外显子组成，长10.2kb，共编码334个氨基酸，在大鼠、小鼠、牛、猪等哺乳动物中具有较高的保守性，已有研究通过动物学模型及生物信息学分析发现Vad1.2基因可能与精子发生存在缺陷有关[2，3]。然而，目前对于Vad1.2基因在精子发生中的确切作用及其分子机制仍不明确。因此，本研究拟通过构建Vad1.2基因表达载体并加以鉴定，以期为进一步明确Vad1.2基因的生物学功能奠定实验基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要实验试剂 　　RNAspin微型RNA提取试剂盒（GE Healthcare）；TaqMan逆转录试剂盒（ABI Biosystems）；pET15b载体（Novagen）；大肠杆菌DH5α感受态细胞（Invitrogen）；QIAquick PCR纯化试剂盒、质粒试剂盒购自QIAGEN公司。Phusion高保真DNA聚合酶，T4 DNA连接酶及Nde1、Blp1限制性内切酶均由NEB公司生产。 　　1.2 Vad1.2表达载体的构建 　　取三月龄小鼠脱椎法处死后，立即取出双侧睾丸，采用RNAspin微型RNA提取试剂盒抽提小鼠睾丸组织总RNA，通过TaqMan逆转录试剂盒反转录成cDNA，采用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。正向引物序列如下：5’- GGGAATTCCATATGGGGGTGACAGGTATCAGT-3’；反向引物序列： 5-CATGCTCAGCCTAGTCATTTCTCTGGGGCTG-3’（引物下划线处表示加入的Nde1及Blp1酶切位点）。上述PCR产物通过QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化，采用Nde1和Blp1限制性内切酶在37°C过夜进行双酶切并再次纯化。随后所得PCR片段采用T4 DNA连接酶定向克隆到pET15b