EB病毒永生化细胞模型__培训课件.pptVIP

细胞永生化技术路线： 培养B95.8细胞 收集EB病毒 分离外周血 淋巴细胞 病毒液和淋巴细胞共培养2小时 离心收集细胞 RPMI1640培养约2月 LCL1-5 LCL2-5 LCL3-5 LCL4-30 LCL5-30 LCL5-30 空白对照 100bp 200bp 300bp 400bp 500bp 600bp 2000bp marker2000 LCLs的LMP1基因mRNA水平的检测,扩增片断长度为424bp. LCL1-5、LCL2-5 、LCL3-5、LCL4-30、LCL5-30都有 LMP1基因mRNA水平的表达 LCLsCD19，CD20抗体的表达 正常外周血淋巴细胞 CD19阳性率为9.6% LCLsCD19，CD20抗体的表达 LCL1-5 CD19阳性率为97.1% LCLsCD19，CD20抗体的表达 正常外周血淋巴细胞 CD20阳性率为12.2% LCLsCD19，CD20抗体的表达 LCL1-5 CD20阳性率为85.3% 空白对照 结论：LCLs细胞来源于B细胞 在转化实验的初期，细胞培养瓶中出现梭形的贴壁生长的细胞，胞体透亮，散在分布。实验中观察发现，这种贴壁细胞是LCLs生长的种子，但不是每个贴壁细胞都能长出细胞克隆，其中部分细胞渐渐死亡。大部分文献都将这种贴壁细胞描述为感染了EBV的淋巴母细胞，但尚未提出有力证据 梭形的贴壁生长的细胞,胞体透亮,散在分布, 是LCLs生长的种子 LCL1-5、LCL2-5、LCL3-5、LCL4-30、LCL5-30均能在软琼脂上生长形成集落 100倍 5株LCLs接种在22只（不包括治疗组）NOD-SCID小鼠的腹腔和右侧大腿皮下。有21只小鼠在腹腔形成了肿瘤，腹腔肿瘤发生率达95%；有9只小鼠在大腿皮下形成了肿瘤，皮下的肿瘤发生率为41%。所有的实验小鼠的存活天数都在28d以上 LCLs在NO-SCID小鼠腹 腔 内 成 瘤 肿瘤发生数（p0.05） 细胞株 NO-SCID 小鼠（只） 腹 腔 内 成 瘤 肿瘤发生的鼠数（只） 实验20天时 小鼠腹腔触诊 实验30天时小鼠腹腔触诊 LCL1-5 4 4 腹腔柔软 可触及腹腔包块 LCL2-5 4 4 腹腔柔软 可触及腹腔包块 LCL3-5 4 3 腹腔柔软 可触及腹腔包块 LCL4-30 5 5 可触及腹腔包块 腹壁明显隆起 LCL5-30 5 5 可触及腹腔包块 腹壁明显隆起 30d时处死小鼠，解剖观察瘤体。LCLs在NOD-SCID小鼠腹腔内形成的肿瘤和周围组织粘连，累及肠系膜等。瘤体积虽大，但仅见少量腹水，未见有肝脏、肺的转移(图a)。发生在小鼠大腿皮下的肿瘤同样与附近的皮下组织和横纹肌粘连(图b)。离体的瘤组织呈结节状，界限清楚，无包膜 a b c a b 瘤组织的HE染色切片(a×50 b×400) 肿瘤细胞弥漫排列，间质纤维稀少。瘤细胞较大，形态多样，呈现大裂-无裂混合细胞，浆样淋巴细胞和免疫母细胞样形态，核分裂常见，可见瘤巨细胞。胞浆丰富淡红染，核膜清楚，核染色质呈粗颗粒状，可见1-3个大小不等的核仁 肿瘤组织病理学 a 部分瘤细胞Lmp1阳性，定位于胞膜 (a×50 b×400) b Lmp1的免疫组织化学染色 a b 瘤组织B淋巴细胞标记(L26)阳性, 定位于胞膜。因此，肿瘤的免疫病理类型是人源B细胞性淋巴瘤 (a×50 b×400) B淋巴细胞标记(L26)免疫组织化学染色 五个LCLs细胞株中LCL1-5、LCL2-5、LCL3-5检测不到端粒酶的活性，LCL4-30和LCL5-30则有较强的端粒酶活性 端粒酶 活性 细胞株 腹 腔 内 成 瘤 皮 下 成 瘤 成瘤率 （p0.05） 实验20天时小鼠腹腔触诊 成瘤率(f=16.3 v=1 p0.05) 平均瘤体大小（cm3） - LCL1-5 92% 可触及腹腔 包块 0 —— LCL2-5 —— LCL3-5 —— + LCL4-30 100% 腹腔柔软 90% 1.5x1.2x0.5 LCL5-30 LCLs端粒酶活性和NOD-SCID小鼠体内成瘤的关系 课题组成员 徐曼 博士后 张彦 博士生 熊建军 博士生 何霞 硕士生 杨黎 硕士生 王嘉励 硕士生 EB病毒永生化细胞模型在 人类疾病基因研究中的应用 朱 振 宇 教授 博士生导师 中山大学 中山医学院 达安基因股份有限公司 EB病毒相关人淋巴母 细胞系的蛋白质表达谱研究 国家自然基 （负责人） 1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒 ◆ 发现 EB病毒是1964年Epstein与Barr在非洲儿童恶