酶组织化学-刘学光.ppt

（2）细胞类型 / 细胞定位 氯乙酸酯酶 → 中性粒细胞 （被抗CD66C, CD66D, CD88抗体的免疫组化代替） 非特异性酯酶 → Mf （被抗CD64、CD68抗体的免疫组化代替） 乙酰胆硷酯酶 → 小肠 神经节细胞 ATP酶 → 皮肤 郎罕氏细胞 （3）癌前病变的标志 以肝癌发生为例 早期，HE无明显变化，但酶组织化学观察到 糖代谢紊乱 肝细胞癌 增生结节 GGT AFP G6P 小肝细胞 过渡细胞 卵圆细胞 肝细胞 嗜碱 嗜酸 （4）免疫组化和杂交组化的显示方法 与酶组化的不同，在于是检测引入酶 免疫组化常用HRP（DAB + H2O2） 杂交组化常用AP （ BCIP + NBT ） 掌握内容 酶组织化学的基本原理 光镜酶组织化学的基本方法 几种重要的酶组织化学方法 Thanks for your attentions! 酶活力调节控制：抑制剂，共价键修饰调节，反馈调节，酶原激活，激素 有些酶是复合蛋白质，其中的小分子物质 * * * 早在1868年由Klebs及Struve（1872）首先证明在中性多性核白细胞中有过氧化酶存在。据1958年记载，酶的数目超过800种，其中仅少数能以组织化学方法证明。1953年只有18种技术可用于显示组织切片中酶的分布，现已有100种以上。 20世纪30年代，随着生物化学的发展和电子显微镜技术的应用，组织化学迎来了复兴时代。自从E. Takamatsu（高松英雄）和G. Gomori 1939年同时证明了硷性磷酸酶的组织化学方法，以后的30年间，酶组织化学得到了飞速发展，高松证明了磷酰胺酶、ATP酶；Gomori设计了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学证明法。 此间，金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，偶氮色素四唑盐法（tetrazolium salts method）以及磷酸化酶组织化学证明法等相继问世。特别是H. Scheldon和D. Brandes等人把电镜与酶组织化学结合起来，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和硷性磷酸酶，奠定了电镜酶组织化学（electron microscope enzyme histochemistry）基础。后来A. M. Seligman(1967)提出锇黑化法（Osmification method）进一步阐述了电镜组织化学的基本原理和反应过程。 1950年，A. H. Coons等人提出了荧光抗体法，从而把免疫学引入组织化学实验中，后来P. K. Nakane，S. Avrameas 和L. A. Sternberger等人以辣根过氧化物酶为标记物对酶进行观察，创立了酶标抗体法，从而为组织化学开辟了新途径。 * * * * * * MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。 * * * 碱性磷酸酯酶即alkalinephosphatase(AP)，可以在Western、EMSA、Southern或Northern等检测时催化BCIP/NBT等显色试剂显色或催化适当的化学发光试剂产生化学发光。 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）是碱性磷酸酶的常用显色底物，常与氧化剂INT（Iodonitrotetrazolium chloride，碘硝基氯化四氮唑）或NBT（Nitrotetrazolium Blue chloride，氯化硝基四氮唑蓝）联合使用来增强检测灵敏度。检测原理（以BCIP/NBT为例）为：在碱性磷酸酯酶（AP）的催化下，BCIP首先被水解去除磷酸基团产生强反应性的中间产物，然后进一步氧化和二聚合产生一种靛青染料（indigo dye）。而二聚合反应中产生的两个还原当量（-2H）能够还原NBT形成不溶性的NBT-formazan，呈深紫色或者蓝紫色。这种检测系统无需额外检测设备，检测结果清晰可见，常用于细胞或组织的碱性磷酸酯酶显色，