第三章 细胞生物学研究方法.ppt

显微注射仪及成像分析系统 产地：日本Nikon公司 型号：PLI-188 注射压力:0.2-60psi DXM1200F 1200万像素 2/3-in. CCD High density 图像分析软件SimplePCI 基因枪 产地：美国Bio-Rad公司 型号：PDS-1000/He 可裂圆片压力:450psi，900psi，1100psi，1300psi，1550psi，1800psi 金粉：0.6um，1.0um，1.6um * * * * * * * * * * * * * * * * 扫描电镜 ?原理与应用： ?电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。 ? CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题 三 扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM 原理：根据隧道效应设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 三、 扫描隧道显微镜 ?Scanning Probe Microscope,SPM 80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器， 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等。 反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 ?分辨率： 侧分辨率：0.1～0.2nm， 纵分辨率：0.001nm ?用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构，观察生物大分子、膜、病毒等的结构。 三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察 第二节 细胞组分的分析方法 1 离心用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 2 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 3 特异蛋白抗原序列的定位与定性 4 细胞内特异核酸的定位与定性 5 放射自显影技术 6 定量细胞化学分析技术 一、 离心分离技术 ?用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 ?差速离心：分离密度不同的细胞组分 ?密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离 差速离心 Differential centrifugation 特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 密度梯度离心 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。 类型：速度沉降、等密度沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。 密度梯度离心： 1 连续密度梯度 不连续密度梯度 常用的介质： 蔗糖、氯化铯、甘油等。 AKTA快速蛋白纯化系统 产地：瑞典安玛西亚公司 型号：AKTA purifier 10 流速：0.001–10 ml/min 压力：0–25 MPa 检测：215，254，289nm pH 范围： 2–12 温度范围：4 °C–40 °C 二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法 ?原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。 Feulgen Staining (DNA)；Millon 染色(蛋白); 苏丹染色(脂类)；PAS反应（多糖）；Gomori 方法（碱性磷酸酶）等。 三、特异蛋白抗原的定位与定性 ?免疫荧光技术 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 ?免疫电镜技术： ?免疫铁蛋白技术 ?免疫酶标技术 ?免疫胶体金技术 应用：能对蛋白进行精细定位。如通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。 ?蛋白电泳(SDS)与免疫印迹反应(Western-Blot) 四、细胞内特异核酸的定位与定性 ?光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针） ?电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） 　　　　　　 ?PCR技术 PCR 技术 PCR即