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高二生物专题1 基因工程人教实验版 【本讲教育信息】 一. 教学内容： 专题1 基因工程 1.1 DNA重组技术的基本工具 （一）教学内容 理解DNA重组技术所需三种基本工具的作用，认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新 （二）教学重点： DNA重组技术所需的三种基本工具的作用 （三）教学难点： 基因工程载体需要具备的条件 （四）教学过程： 1. 基因工程的原理 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 和 ，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 水平上进行设计和施工的，因此又叫做 。 2. 限制性核酸内切酶 限制酶——“分子手术刀”掌握限制酶的作用，切割后产生的结果，关注限制酶从哪里寻找？噬菌体侵染细菌的实验——单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？ 在生物体内有一类酶，它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。限制酶是基因工程中所用的重要切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶限制酶识别序列的长度? 限制酶识别序列的长度一般为 4—8 个碱基，最常见的为 6 个碱基（表2—3）。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（4^4=256，4^6=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置。4 个碱基识别位点：Sau3A??↓GATC 5 个碱基识别位点：EcoR? ?↓CCWGG? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 6 个碱基识别位点：EcoR? ? G↓AATTC? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 7 个碱基识别位点：BbvC? ? CC↓TCAGC? 8 个碱基识别位点：Not? ???GC↓GGCCGC? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? B. 限制酶切割的位置限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3A（↓GATC）、Nla（CATG↓）和 EcoR（↓CCWGG） 等；在两侧的有 Bcg[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspR（CASTGNN↓）， Bcg 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有 Bbv[GCAGC（8/12）] 和 BspM[ACCTGC（4/8）] 等。. 限制酶产生的末端限制酶产生匹配粘端（matched ends）识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称轴 5 侧切割底物， DNA 双链交错断开产生 5 突出粘性末端，如 EcoR ；若在 3—侧切割，则产生 3 突出粘性末端，如 Kpn 。限制酶产生平末端（Blunt end） 在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如 Hae（GG↓CC）和 EcoRV（GAT↓ATC）。产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较粘性末端低。限制酶产生非对称突出端许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的，如 BbvC ，它的识别切割位点如下。? ?? ?? ?? ?? ?CC↓TCAGC? ?? ?? ?? ?? ?GGAGT↑CG 有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如 Acc ，它的识别切割位点如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 为非对称。? ?? ?? ?? ?? ?GT↓AT/CGAC ? ?? ?? ?? ?? ?CATA/GC↑TG 有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如 Dra 和 Ear大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD（而不是ATP）反应形成酶—AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上