第八章免疫标记技术精选.ppt

胶体金试纸条示意图 检测线 质检线 吸收垫 样品垫 硝酸纤维素膜 连接垫 （胶体金垫） 背衬 （底板） * 测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。 测 定 * 若标本中有待测特异抗原，即可与免疫金复合物中的抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体捕获，在膜上显出红色反应线条（T）。 测 定 * 测 定 过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相抗小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。 * 测 定 阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。 * 胶体金快速诊断技术的特点 简捷快速：操作简单，一般只要5-10min 就会出结果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR 需要时间更长。 结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。 特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。 * 病毒性疾病：传染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬细小病毒、猪瘟等。 寄生虫疾病：血吸虫病、旋毛虫病、囊虫病、恙虫病。 细菌性疾病：霍乱弧菌、类鼻疽。 胶体金快速诊断技术的应用 * H5亚型AIV尿囊液阳性结果 阴性对照 阴性对照 H5ＡIV细胞毒阳性结果 * * 磁分离技术原理： * b. 1921 * 二十世纪40年代，Coons等首先用荧光素作为示踪物质标记抗体，检测可溶性肺炎双球菌多糖抗原，从而创建了免疫荧光示踪技术。 * 三结合 * 将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原。 * 此板在室温下避光保存。 使用时应注意BCIP/NBT缓冲液是潜在的致癌物质，试验时带手套，使用后适当处理。对MAIPAN4510板，孵育时由于毛细作用，试剂渗入膜中，此液体难以洗去，因此导致背景增加。为了避免此情况，建议在步骤12时将板底移去，将膜倒转，用蒸馏水流冲洗，同时用洗涤缓冲液按正常的步骤洗涤。在步骤14中，由于板底已移去，建议将MAIP4510板放于空的96孔板上，其后的步骤不变。 * 操作过程 1. 用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育10分钟。 2. 倒去酒精，用100ul PBS洗涤3次。 3. 将100ul捕获抗体加入10ml PBS中，混合， 每孔加100ul， 盖上板盖，4℃过夜。 4.倒去液体，100ul PBS洗涤一次。 5.每孔加入100ul 2%脱脂乳PBS（见试剂准备），盖上板盖，室温下孵育2小时。 6.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。 7.用100ul PBS洗涤一次。 8.每孔加入100ul细胞悬浮液（含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂）。细胞可预先在体外接受刺激（间接Eli-spot）。盖上标准的96孔板塑料板盖，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间（15-20小时）。这期间不要晃动或移动孔板。 9.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。 10.每孔加100ul洗涤缓冲液，4℃孵育10分钟。 * 11.用100ul洗涤缓冲液洗孔3次 12.于10ml PBS-1%BSA中稀释100ul检测抗体，此为一板的量。每孔加100ul此液体，盖上板盖，37℃下孵育1小时30分。 13.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。 14.每板以10ml PBS-1%BSA稀释10ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100ul此液体，盖上板盖，37℃孵育1小时。 15.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。 16.每孔加入100ul BCIP/NBT。 17.室温下反应5-15分钟。完全显色后，将此液倒于相应的盘中。 18.用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，读取点数。4℃下放置一夜，点会比较明显。 * * * * 返回 * * 四、通用与放大技术 1 ．SPA通用系统 2．ABC放大系统 返回 * （1）SPA的发现 1940年Verwey发现金黄色葡萄球菌的某些菌株，可与人正常血清在双相免疫扩散试验中出现沉淀线。 1958年Jensen用离子交换树脂分析证明，该成分是一种细菌胞壁上不含糖的蛋白质，命名为金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A，SPA) * Forsgren等证明SPA与IgG分子的Fc段结合，为非特异免疫反应。 生产SPA的国际标准菌株: Cowan Ⅰ株（NcTc8530 和ATCC12598） 不生产SPA的标准株: Wood46 返回 * （2）颗粒SPA的应用 协同凝集试验 SPA吸收IgG试验 应用IgG-SPA制备抗IgG的抗体 返回 *