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微生物的分离与纯化 实验目的、要求 （1）学习微生物的分离技术。 （2）学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 （3）学习平板菌落计数法。 以细菌为例 实验原理 纯种分离技术 分离：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯种的方法。 纯种（纯培养）：一个菌落或一个培养物中所有的细胞是由一个细菌（或细胞）分裂繁殖而产生的后代。 微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌种及纯化被污染的菌种等。 土壤是微生物的大本营，混杂着大量的微生物，从中分离可得到只含有这一种微生物的纯培养。 实验材料 菌源:土样10g; 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基; 实验仪器与用具 1)超净工作台、恒温培养箱、酒精灯 2）1000ul及100ul移液枪、1000ul及100ul枪头、无菌1.5ml的离心管、离心管架 3）无菌平皿、涂布器、接种环 实验试剂:无菌水; 实验内容 1、土样取样: 选择肥沃土壤,去表层土,挖3－8cm深度的土壤数10g,装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋口,带回实验室。 2、制备土壤稀释液： 称取土样1.0g，放入盛99ml无菌水的三角瓶中，置摇床振荡20min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。用100ul移液枪从中吸取100ul土壤悬液，注入事先分装有900ul无菌水的离心管中，吹吸3次，振荡均匀（10-3）。然后同样方法，配置成稀释度为10-4，10-5的土壤菌悬液。 3、分离稀释涂布平板法 用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌涂布器涂匀。每个浓度做3个平板（重复）。 注意：无菌操作；用枪头吸取菌悬液时注意“吹打数次”确保混匀。 4、培养 待平板上液体被完全吸收，将平板倒置于370C温箱中培养24h； 5、菌落计数含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可据平板上菌落的数目推算出每克含菌样品中所含的活菌总数（菌落形成数目）。选择平均菌落数在30~300间的平板，求其平均值。 每克含菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数（同一稀释度平板上菌落平均数× 10×稀释倍数）/含菌样品克数 6、平板划线法 挑取单个菌落（细菌菌落），分别在平板上做分区和划线。 370C培养48h检查菌落是否单纯。 无菌操作（ 近火焰处操作）： 划线方法： ：灼烧、冷却、取菌 区1划线 灼烧、冷却 区2划线 区3划线 灼烧、冷却 区4划线…… 完毕、灼烧 结果与讨论 计算含菌样品中的所含活菌总数 在恒温箱中培养微生物时为何要倒置？ * * 分离纯化：菌种被其他杂菌污染或混合菌悬液常要进行分离纯化； 方法有平板划线法和稀释涂布平板法两种。 要获得某种微生物的纯种，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。 细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，在30-37℃ 温度下培养1-2天。 平板菌落计数——活菌计数 0.9 0.1 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.9ml 分离纯化基本流程 实验仪器、材料 菌落计数规则： 选择平均菌落数在30~300间的平板 1、只有一个稀释度符合，则以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数； 2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）： 1）若0.5≤比值≤2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值。 2）若2≤比值或比值≤ 0.5，则取其中较少的菌落总数。 3、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数； 4、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告； 所有菌落数均不在30~300间 以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数