翻译-Gradient_overview_with_notes.docxVIP

文稿边栏附注前言Michael Woodman：嗨，大家好！我是 Mike Woodman，是安捷伦公司的一名应用专家。今天和我在一起的是安捷伦在线技术支持部的Rita Steed，你们中的一些人可能在过去曾经和他通过电话。Rita：嗨，大家好！这真是可能的! 我们接到过来自不同地区的许多求助电话。Michael：在本次讨论中，我们将关注梯度洗脱以及如何建立梯度分析方法的问题，并且讨论梯度分析中易犯的常见错误以及如何处理它们。首先，我们来重温一下梯度方程，这样就能理解当进行梯度分析时，我们如何去调整方法的变量。然后，我们来讨论流动相改性剂，以及它们是如何引起基线问题的。最后， 我们将讨论延迟体积的重要性，以及如何解决它们，以避免梯度分析方法在不同系统之间应用时组分的保留时间发生变化。Mike Woodman 是一名应用化学家，致力于安捷伦仪器应用的研究。Rita Steed就职于安捷伦HPLC色谱柱技术支持部。 为什么使用梯度洗脱？Rita： 那么人们为什么使用梯度洗脱呢？随着色谱分析变得愈加复杂，人们越来越多地使用梯度洗脱。 当在组合化学或杂质分析中需要分离一些未知化合物时，梯度洗脱就非常有用。梯度洗脱也有助于分离极性差异大的化合物，或者高分子量化合物，如肽类和蛋白质类。在梯度洗脱中，流出各峰的宽度基本上是相同的，不像等度洗脱时，某组分在色谱柱中停留的时间越长，色谱峰就越宽。梯度洗脱还有其它的优点，包括由于梯度压缩效应使峰形更尖锐，并且由于梯度洗脱中色谱柱不断被逐渐提高强度的溶剂冲洗，从而最大程度地减少了污染积聚。梯度洗脱分析可用于： 分离一些未知化合物组合化学研究杂质分析分离极性差异大的化合物，或者高分子量化合物，如肽类和蛋白质类。梯度方程Rita：我们一起来看一下梯度方程，并去理解梯度方程是如何使用的。[show gradient_equation.gif]这个梯度方程乍看起来有些令人生畏，但如果您进一步再对它稍作了解，您就会看到事情并非想象的那样。它涉及了影响您分析的关键变量，如果您不理解这些变量，也许会给您的色谱分析带来问题。请看这是[point as discussed]流速、梯度程序时间、梯度范围和柱体积。谨记分母如果发生变化，分子就一定要做出相应改变来补偿，反之亦然，这一点非常重要。增大保留因子k（或k*，梯度洗脱中）是一个简单的提高分离度的方法。不过，这会以更长的运行时间为代价。此外，还会导致峰宽增加，峰高降低，从而使使定量分析变得更加困难。Mike：目前，改变色谱柱的尺寸非常普遍，更短或者内径更窄。因此，柱体积的任何减小，都需要通过成比例减小梯度程序时间或增大流速来补偿。Rita：当我们应用方法到不同尺寸的色谱柱上时，一个可以帮助我们的极好途径就是使用安捷伦方法转换器软件。 它能帮您确定您是否已经调整好了所有相关的方法参数。您可以登陆，通过搜索找到方法转换器。它有几个版本， 包括在Agilent 1290 Infinity LC上适用的一款。 [show search and bring up Method Translator on screen][Demonstrate on screen]比方说，您正在使用经典的4.6 x 250 mm，5 μm色谱柱。 您可以看到您在转换器中有两种选择：基本模式和高级模式。在本例中我们选择基本模式。基本模式设定为您正在使用的是一台常规HPLC仪。在色谱柱部分，我们输入色谱柱的规格为内径4.6 mm、长度250 mm、粒径5 μm。在方法部分，我们需要输入温度信息，这里设为30 ℃，流动相设为水/甲醇。注意当我们如上操作时，最大黏度值发生了变化。为了了解那个数值是从哪里来的，让我们去看一下黏度表。您可以看到我们有一张关于水/乙腈和水/甲醇的表，以及一张其它相关HPLC溶剂黏度的信息表。由于我们的梯度分析系在30 ℃时使用甲醇/水作流动相，因此我们需要查看30℃时流动相的黏度。我们看到这个条件下该流动相的 最大黏度是1.47，这也是我们使用的转换器的默认值。接下来我们输入流速、进样体积及梯度程序条件。为简单起见，我们将保持所有这里默认的条件不变。现在让我们设定一个新的方法。在基本模式下，默认的仪器是1200 RRLC系统。如果您使用的是高级模式，您可以设定系统信息以适应您使用的仪器。输入我们使用的新色谱柱的规格2.1 x 50 mm，1.8 μm。由于改变了色谱柱内径，我们可以看到转换器已经成比例地调整了流速。虽然进样体积不是梯度方程中的变量，但考虑到原色谱柱与新色谱柱柱体积的差异，软件也会成比例调整进样体积。注意由于我们改变了柱长，因此梯度程序时间也发生了变化。在本例中，我们做了简单的转换，但是您同时还可以优化出峰速度或分离度。高级模式中的其它功能还有待您去探索。M