CTAB法原理总结.docVIP

富含多糖和次生代谢产物的白桦成熟叶中总RNA的提取 植物生理学通讯 曾凡锁 酚类物质是植物所特有的次生代谢物，它很容易被氧化成褐色的醌类物质，醌类物质与 RNA的不可逆结合，不仅会使RNA的活性丧失，而且在苯酚和氯仿抽提时还会使RNA丢失，因此富含次生代谢产物的植物RNA提取一直是RNA分析研究中的障碍。 要获得完整性好的RNA，植物细胞破胞必须完全、迅速。细胞破碎不完全，不仅使RNA产量降低，而且还会因为植物细胞内部结构的破坏而产生内源性降解；时间过长则已释放的RNA酶还有可能会产生活性而降解RNA。因此这是能否获得高质量RNA的最为关键性的一步（王玉成 2002）。 其次则应考虑如何去除多糖。但CTAB法通常要结合其他操作才能有效去除多糖，常见的方法有低浓度乙醇沉淀法、醋酸钾沉淀法、氯化锂沉淀法、提高缓冲液的氯化钠浓度等。其中用氯化锂沉淀RNA是RNA提取中的常用方法，此法制备的RNA具有纯度高和无多糖等生物大分子共沉淀等优点。 改良CTAB-LiCl法提取枣总RNA体系的建立 中国农学通报 宋蓓 比较不同沉淀方法 CTAB较其它几种试剂更能有效去除多糖和酚类等物质。β-巯基乙醇和PVP去除酚类， KAc及无水乙醇去除多糖。 RNA的沉淀方法很多，如LiC1、异丙醇、NaAc和无水乙醇等。本试验对不同的方法进行了比较，其中LiC1沉淀需要在4℃放置过夜，时间长，但是RNA的产率比后两种方法高很多，且RNA纯度好，没有DNA污染，不需要进行去除DNA的纯化操作，减少了RNA降解的几率；LiC1本身沉淀大片段RNA效果好的特点使得到的RNA大片段损失很少，更适于进行后续的分子生物学试验；而异丙醇沉淀获得的沉淀体积大，导致了多糖和酚类物质的共沉淀作用；1/10体积3 mol/L的NaAc和2.5倍体积的无水乙醇所得的RNA产率较低，且和异丙醇沉淀方法一样存在基因组DNA的污染，后续的纯化操作提高了RNA提取的成本且增加了降解的机会。 几种果实总RNA提取方法的评价 广东农业科学 陈弟 多种RNA提取方法的原理 Trizol法即异硫氰酸胍—苯酚法，异硫氰酸胍可以抑制RNA酶、防止RNA的降解，而酚的作用是使蛋白变性。其原理是内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸；由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。 热硼酸法 (Hot-borate，简称HB法)的原理是将硼酸缓冲体系、蛋白酶K消化蛋白和LiC1选择性沉淀RNA等步骤偶联在一起。硼酸可与酚类化合物依靠氢键形成复合物，二硫苏糖 醇(DTT)作为还原剂，NP-40可阻止酚类物质氧化，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可与多酚化合物形成复合体，这些物质都可以抑制植物组织中酚类物质的氧化及其与RNA的结合，通过LiC1沉淀剩余的酚类物质，从而与RNA分开。 异硫氰酸胍法(Guanidine Thiocyanate，简称GT法)的提取液包括4 mol/L异硫氰酸胍、25 mmol/L柠檬酸钠( p H 7.0 )、0.5％十二烷基肌酸钠、0.1 mol/Lβ-巯基乙醇。其中，异硫氰酸胍作为强变性剂使核酸一蛋白结构发生变化，并有效解离核蛋白与核酸的复合体， 与β-巯基乙醇共同对RNase产生强烈的抑制作用，这样能破裂细胞并迅速释放核酸，然后通过CsCl梯度密度离心去除DNA，有效地得到总RNA。 十二烷基硫磺酸钠法(Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS法) 的提取液有 0.1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)、0.05 mol/L EDTA (pH8.0)、0.5 mol/L NaC1、1.5％SDS、0.01％β-巯基乙醇。SDS是一种离子去污剂，能从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖；EDTA以螯合二价金属离子，抑制RNA酶的活性，防止RNA降解；Tris-HCl不仅起缓冲作用，还可防止RNA降解；NaC1溶液可提供缓冲反应环境。在缓冲液中加入抗氧化剂或强还原剂(如β-巯基乙醇)，可以降低酶类(尤其是氧化酶类)的活性。通过苯酚和氯仿等有机溶剂的抽提去除蛋白质、多糖和酚类等杂质后，加入无水乙醇进行沉淀，即可使RNA分离出来。 十六烷基三甲基溴化铵法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide． 简称CTAB法)的抽提缓冲液包括2％ CTAB、100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1.4 mol/L NaC1、20 mmol/L EDTA (pH 8.0)。其中，CTAB作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使RNA得以游