蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE题材.pptVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离血清蛋白质 1 强化学生对电泳基本原理的理解与记忆。 2 熟记聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的基本原理、学会操作。 电泳原理 带有电荷的颗粒在电场中泳动的现象叫电泳。带正电荷的泳向负极，带负电的泳向正极。 许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。 因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。 影响电泳速度的因素： 样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 电泳介质的pH和离子强度 一般来说，带电越多，分子量（颗粒）越小而且是球形的，则泳动速度就快。反之，则慢。 蛋白质N端游离氨基，C端游离羧基以及侧链上一些基团在一定pH条件带电荷， 因此可以用电泳技术分离和鉴定。 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)是一种人工合成的凝胶，它是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE) 丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）→（催化剂） →聚合 催化剂：过硫酸铵 AP＋四甲基乙二胺（TEMED） 改变单体和交联剂浓度可改变凝胶孔径 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两类。圆盘电泳和板状电泳原理相同。 分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。 电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。 实验器材 垂直板电泳装置 电泳仪 制胶架 移液枪 移液管 烧杯 培养皿 离心机 操作方法 制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层蒸水(约3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。 将上、下贮槽的蒸馏水倒去 ，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合。 制备凝胶板 将两块玻璃板组成灌胶模具 注意：安装前，胶条、玻璃板都要洁净干燥； 勿用手接触灌胶面的玻璃。 矮板朝里，高板朝外 注意检查是否漏水 选择合适的分离胶浓度，按表配制所需分离胶溶液。 待分离胶聚合后（约20分钟），倾去表面液体，多余的液体用滤纸条吸干。 按配方配制浓缩胶溶液 浓缩胶的聚合 丙烯酰胺 0.7ml （1000移液器调到070） 浓缩胶缓冲液pH6.7 3.0ml TEMED 0.4ml 蒸馏水 1.0ml 2.5%AP 0.08ml （100移液器调到080） 将电极芯放入电泳槽 倒入电极缓冲液，内槽高度到上样孔上方，外槽高度稍矮 上样 每孔50UL 电泳 将电泳仪连接，打开电泳仪开关，开始时电压为80 V，待样品进入分离胶后，将电压调至120V，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源。 染色和脱色 取下凝胶，放入染色液中，观察到明显蓝色条带后放入脱色液中浸泡。 考马斯亮蓝染色配方：R250，0.29克；乙醇，250毫升；冰醋酸，80毫升；加蒸馏水至1000毫升。 结果观察 请同学注意 电极芯贵重，请直接用水冲洗，勿用刷子刷洗 玻璃板易碎，请小心 胶勿直接倒入水槽，请倒到胶桶里 移液器注意使用规范 注意事项 丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤，呼吸道等吸收，故操作时一定要注意防护。 蛋白加样量要合适。加样量太少，条带不清晰；加样量太多则泳道超载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。 对多种蛋白而言，电流大则电泳条带清晰，但电流过大，玻璃板会因受热而破裂。 过硫酸铵溶液最好为当天配置，冰箱里储存也不能超过一周。 * * 实验目的 COO- COO- COOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ + OH-