现代生物化学作业现代生物化学作业.doc

动物科技学院 兽医硕士 冯柳柳 2013120181 1.举例说明原核基因表达调控的详细机制 原核生物是一些由无真正的细胞核的细胞组成的单细胞或多细胞的低等生物。原核生物包括古菌（有时单独分类为古核生物）和细菌（真细菌，其中包含支原体和蓝藻门，有时“原核生物”一词仅指真细菌）。一般没有细胞内膜，没有细胞核膜，但依然有遗传物质，例如：DNA、RNA等。原核生物的DNA伴随些许蛋白质和核糖体，并以游离的形成存在于细胞质中。原核生物包含蓝绿菌和细菌，细菌一型态又可分为杆菌球菌螺旋菌。在双链DNA中，作为转录模板的链称为模板链（template strand）或反义链（antisense strand）；而不作为转录模板的链称为编码链（coding strand）或有义链（sense strand），编码链与模板链互补，它与转录产物的差异仅在于DNA中的胸腺嘧啶（T）变为RNA中的尿嘧啶（U）。在含许多基因的DNA双链中，每个基因的模板链并不总是在同一条链上，亦即可作为某些基因模板链的一条链，同时也可以是另外一些基因的编码链。当血糖含量降低时，，糖原磷酸化酶激酶和糖原磷酸化酶ATP和柠檬酸水平高时， PFK受抑制，降低糖酵解的速率，柠檬酸增加果糖-1、6-二磷酸酶活性，从而增加糖异生速率。 3.详述在你论文设计中可能用到的现代生化与分子技术的原理和流程 论文内容：减蛋综合征病毒的致病性 结合论文设计，我的实验可能用到的生物化学和分子生物学技术主要有：引物设计、荧光定量PCR、ELISA 1.引物设计： 原理：PCR引物设计的11条黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72。GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。4.引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5.引物3′端不能选择A，最好选择T。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。6.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8.引物5′端和中间G值应该相对较高，而3′端G值较低。G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间G值相对较高，而3′端G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的G值可以用Oligo6软件进行分析）9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰