取绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾脏，制成脾细胞悬液.pptVIP

免疫学实验二 原理： 取绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾脏，制成脾细胞悬液，与一定量的SRBC和补体混合，注入自制的小室内，经37℃孵育后，单个散在的抗体形成细胞释放Ab，Ab与周围的SRBC（Ag）结合，并在补体参与下，使绵羊细胞溶解，结果在抗体形成细胞周围形成肉眼可见的圆形透明溶血区——溶血空斑。计算溶血空斑数目，则可推算脾内存在的抗体产生细胞总数。 材料： 1. 健康小鼠一只 2. 解剖器械 3. 注射器，平皿 4. 20%绵羊红细胞（SRBC）悬液 5. 洁净脱脂载玻片（75ⅹ25mm），盖玻片（22ⅹ22mm） 6. pH7.2的Hank’s液，凡士林 8. 指示细胞悬液，配制方法如下： 20%绵羊红细胞 0.5ml　 补体（新鲜豚鼠血清）0.5ml  含5%小牛血清的Hank’s液 方法： 1．免疫动物 取20%绵羊红细胞悬液1毫升，无菌操作注入小鼠腹腔中。 2．脾细胞悬液的制备 （1）小鼠免疫4天后，颈椎脱位处死，固定于木板上. （2）取脾：用酒精棉球擦湿腹部，用剪刀沿正中线剪开皮肤和腹腔，打开腹腔后，将鼠胃向上翻转，暴露出脾脏，钝性分离脾周围软组织，用剪刀剪下脾脏放入平皿内。 （3）冲洗脾脏：左手持一把小镊子夹住脾脏，右手用注射器吸取3mlHank’s液缓缓注入脾内，将脾细胞冲出来，如此反复几次，直到脾脏变白为止。 （4）倾斜平皿用注射器将平皿中冲洗液移至试管中。 （5）离心：1000转/分,离心5分钟，弃上清。加Hank’s液使总量达3毫升。用乳头吸管吹打使沉淀细胞悬起混匀，制成脾细胞悬液。  * * 实验内容 一、溶血空斑实验 二、抗链球菌溶血素O实验(ASO) 一、抗体产生细胞的检测 ——溶血空斑试验 目的： 通过补体的溶血反应，了解补体的生物学功能及体外抗体形成细胞检查法。 （6）重新取一只试管，取脾细胞悬液0.1ml，加醋酸结晶紫1.9ml混匀后灌板计数。按计数结果加Hank’s液调配细胞浓度为1×107/ml，备用。 注：细胞浓度的调配 1）每个大格的液体体积：10-4ml 2）一个大格内的细胞数（n）： 对角线2大格内细胞总数和/2 3）现有细胞浓度：2n x 105个/ml 4）将细胞悬液浓度调定到1x107个/ml的方法： 用一支新试管取1ml原浓度细胞悬液，向其中加入V=2n x 10-2 – 1（ml）的Hank’s液 3.细胞混合液的配制 取小试管一只，用吸管吸取0.5毫升指示细胞悬液，用另一吸管吸取0.5毫升脾细胞悬液，混匀即为被检的细胞混合悬液。 4.玻片小室的制作 取洁净（无油）的载玻片，粘三条两面胶带，然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。 玻片小室 5.混合细胞的灌注 用注射器吸取被检细胞混合悬液，于小室开口一端轻轻将液体注满小室（勿使气泡产生，勿使液体外溢）。 6.用牙签粘取少许凡士林密封小室上下开口。 7.将作好的标本水平置湿盒中，放37℃温箱 中孵育20～30分钟。 8.溶血空斑观察 二、抗链球菌溶血素“O” (ASO)实验 原理 1.溶血素O由乙型溶血性链球菌产生,刺激机体产生抗体称为抗O抗体(ASO)。ASO滴度超过200IU/ml是链球菌感染的标志，这个滴度会持续4-6周。 2.血清中ASO的测定可用于链球菌感染的诊断。 3.ASO测定试剂盒中的胶乳试剂是溶血素“O”和羧化聚苯乙烯胶乳共价交联而成的胶乳抗原。ASO胶乳灵敏度调整到200IU/ml，超过上述滴度即可出现肉眼可见的凝集颗粒。 材料 1.ASO乳胶试剂，用时要摇匀 2.阳性控制血清 3.阴性控制血清 4.待检人血清