第五章 色谱法-1.docVIP

第五章 色 谱 法 重点: 基本原理、分类、特点及应用范围，仪器基本构造、色谱条件选择及定性定量分析 难点: 基本原理、色谱条件选择及定性定量分析 §1 概 述 色谱法的实质 色谱法：利用混合物中各组份在互不相溶的两相(固定相和流动相)中的吸附能力、分配系数或其他作用性能的差异,进行分离和测定的一类分析方法。 色谱法实质上是一种分离与检测结合的技术。1906年由俄国植物学家茨维特(Tsweet)分离植物色素时创立。见图。 固定相: 固定不动的一相; 流动相：携带样品流经固定相的流动体。 当流动相中的样品混合物经过固定相时,会与固定相发生作用,由于各组分性质、结构上存在差异, 与固定相的作用强弱差异大,不同组分在固定相中的滞留时间有长有短,从而按先后次序从固定相中流出，即彼此分离，形成色谱图。 二．分类 按两相状态分 流动相为气体者称气相色谱(GC)。其中固定相是固体吸附剂时称气固色谱(GSC); 固定相是固定液(附着在惰性载体上的一薄层有机物液体)的称为气液色谱(GLC)。 流动相为液体者称液相色谱。分液液色谱、液固色谱。如高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱、离子色谱(IC)、毛细管电泳(CE)等。 流动相为超临界流体的色谱称为超临界流体色谱(SFC)。 按分离机理分 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等。 吸附色谱:利用组分在吸附剂上的吸附能力强弱不同达到分离目的; 分配色谱: 利用组分在固定液(固定相)中的溶解度不同达到分离目的; 离子交换色谱: 利用组分在离子交换剂上的亲和力大小不同达到分离目的; 凝胶色谱：利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离目的; 亲和色谱: 利用不同组分与固定相(固定化分子)的高专属性亲和力进行分离的色谱法,常用于蛋白质的分离。 按固定相外形分 柱色谱:固定相装于柱内的色谱法; 平板色谱: 固定相呈平板状的色谱法,可分为薄层色谱和纸色谱。 三.色谱图及有关术语 色谱图 组分在检测器上产生的电信号（强度）对时间作图，所得曲线称为色谱图。又称色谱流出曲线。曲线上突出的部分就是色谱峰。见图 正常的色谱峰是对称的高斯(Gauss)正态分布图。 基线 实验条件下,色谱柱后没有组分流出、只有流动相进入检测器时的信号--时间曲线称为基线。稳定的基线是一条水平直线。若为斜线，称为基线漂移；若基线上下波动，就称为噪声。 保留值 表示各组分在色谱柱中滞留时间的数值，通常用时间或将组分带出色谱柱所消耗流动相的体积来表示。条件一定时，每一种物质都有一个确定的保留值，故保留值可作为定性的依据。 （1）时间tＭ（t0）: 不与固定相发生作用（吸附或溶解）的物质从进样到出现色谱峰峰值所需的时间。其运动速度与流动相的平均线速度u相同， u与柱长L及tＭ的关系： u=L/tＭ (5-2) (2)保留时间tR ：组分从进样到出现其色谱峰值所需的时间。 (3)调整保留时间tRˊ：扣除死时间后组分的保留时间。是组分在固定相中实际滞留的时间。 tRˊ= tR- tＭ (5-3) 由于组分在色谱柱中的保留时间tR　，包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中实际滞留的时间,tR实际上是组分在固定相中停留的总时间。 色谱保留值也可用保留体积来表。 (4) 死体积VM 指不与固定相发生作用的物质从进样到其色谱峰峰值出现所消耗的流动相的体积。即色谱柱内所有空隙的总体积。 VＭ=tＭ·FC0 (5-4) 式中,FC0—经校正后的流动相体积流速，(mL.min-1)。 (5) 保留体积VR 组分从进样到其色谱峰峰值出现所消耗的流动相的体积。 VR = tR?Fc0 (5-6) (6)调整保留体积VRˊ 某组分扣除死体积后的保留体积。 VRˊ= VR- VＭ= tRˊ?FC0 (5-7) (7)相对保留值r2,1 某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比,，又称选择因子。 r2,1= tR2ˊ/ tR1ˊ= VR2ˊ/ VR1ˊ (5-8) 在定性分析中,通常固定一个色谱峰作为标准(s),然后再求其它峰(i)对这个峰的相对保留值： r2,1= tRˊ(i) / tRˊ(s) 　　 (5-9) 规定：tR (i)ˊ为后出峰的调整保留时间，所以r2,1总是大于1。 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关,而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关,所以在色谱法特别是气相色谱法中广泛用作定性依据. 4. 色谱峰宽、峰高和峰面积 色谱峰宽有三种方法表示： (1)标准偏差σ: 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。见图 (2)半峰宽Y1/2（或W1/2）: 峰高一半处对应的峰宽。 Y1/2 =2.355σ