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核酸的分子杂交技术 一、核酸分子杂交 用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。 待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。 二、核酸分子杂交的分类 液相杂交 核算分子杂交 印记杂交 固相杂交 原位杂交 1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。 2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。 常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。 三、核酸分子杂交的基本原理 1、变性： 在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。 ﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 ﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。 ﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。 增色效应： DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。 DNA热变性现象　双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。增色效应和减色效应　当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。 A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。 Tm=（G+C）%×0.41+69.3 Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。 2、复性 在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。 在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。 ﹡复性过程： 第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链，这种局部的双链是暂时的，若周围的碱基不能配对就会重新解离，一旦找到正确的互补区，则其局部双链形成核（成核反应），然后核两侧的序列迅速配对，形成完整的双链分子。 ﹡影响复性的因素 单链核酸的起始浓度：反应开始时的总浓度可直接影响单链分子碰撞的几率，浓度越高，复性越快。 核酸链长度（分子量）：分子越长，扩散越慢，形成配对的难度也大，复性也慢。 核酸分子的复杂性：复杂性即核酸分子中不同序列的总长度，复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢。 温度：温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复性温度是比Tm低25℃。 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。 3、杂交 ﹡来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。 ﹡杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、DNA与RNA之间的杂交。 ﹡核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA或RNA片段上带上可检测的标记，可用来检测样品中未知的核酸序列。 ﹡影响核酸分子杂交的因素： - 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大。 - 离子强度：高离子强度溶液中，正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，削除相互间的静电斥力，有利于杂交分子形成。 - 温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进行杂交。 - 添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。 - 杂交条件的严谨性：指杂交反应体系中，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。它主要与杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关。实际操作时，一般采用较低严谨性杂交以提高反应速率，以较高严谨性洗膜以尽量洗去非特异性结合和配对较差的探针，以提高特异性。 4、预杂交 为了减少探针与广泛存在的