四核酸化学重点.ppt

3. Western blotting 将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素标记的特定蛋白质之抗体进行反应。 4、基因芯片 六、DNA的序列测定 DNA测序的解决得益于：高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳和限制性内切酶两种技术。 Maxam、Gilbert提出的化学断裂法 Sanger提出的双脱氧法 1、双脱氧法 双脱氧法也叫末端终止法 DNA复制的过程：DNA是一种双螺旋分子，其复制是在DNA聚合酶催化下，以原来的两条母链上的核苷酸序列为模板，通过互补配对的方式合成新DNA链的过程。复制需要引物和四种dNTPs，总是从5′-端向3′-端进行。细胞内DNA复制的引物一般是RNA，但体外DNA复制的引物可以是人工合成的与模板链互补的一段寡聚脱氧核苷酸。复制开始于引物3′-端自由的羟基，依据碱基互补配对的原则，不断地形成新的3′,5′-磷酸二酯键，使DNA链得到延伸，直到一个新的DNA分子完全被合成。 末端终止法步骤 进行四组平行反应 每一组反应混合物含有dATP, dGTP, dCTP和dTTP，被32P标记 每一组反应含有一种少量的ddATP或ddGTP或ddCTP或ddTTP。 在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸。 有时，聚合酶使用ddNTP，而导致末端终止。 每一组反应中ddNTP的随机插入留下一系列长度不等的以该双脱氧核苷酸结尾的DNA链。 对每一组反应混合物走凝胶电泳。 片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部。 从凝胶的底部向上读出序列。 将读出的序列转化成互补链的序列。 DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP 2、杂交的两条链:　一条可以是待测的单链的核酸分子，如克隆的基因片断、PCR产物、基因组DNA或细胞总RNA等。另一条可以是探针。 　 3、核酸探针 　　 通常对天然或人工合成的DNA或RNA片段进行放射性同位素或荧光标记，做成探针。 核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。 DNA-DNA 杂交双链分子 变性 复性 4、核酸分子杂交的应用: 研究基因的位置 确定两种核酸序列的相似性 检测样品中的特异序列 基因芯片技术的基础 第六节 核酸的研究方法 一、核酸的分离、提纯和定量测定 二、核酸的超速离心 三、核酸的凝胶电泳 四、DNA聚合酶链反应(PCR) 五、印迹技术 六、核酸的核苷酸序列测定 一、核酸的分离、提纯和定量测定 (一)DNA和RNA的分离 DNA为白色纤维状固体，为线性分子，极不对称，溶液粘度高。对碱稳定，溶于浓盐中。 细胞破碎、浓盐抽提、稀释DNP沉降、苯酚抽提（氯仿-异戊醇）、乙醇沉淀、乙醚和乙醇洗涤沉淀、纯DNA。 SDS缓冲液中加光谱蛋白酶，65℃保温、苯酚抽提、RNase 氯化铯密度梯度离心 RNA为白色粉末，溶液粘度低，对碱不稳定 酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提 胍盐/氯化铯密度梯度离心 注：灭菌：玻璃器皿高温焙烤、塑料高压灭菌、DEPC焦磷酸二乙酯 处理；加变性剂 (二)核酸含量的测定  紫外分光光度法、定磷法、定糖法  定磷法：钼蓝比色法 定糖法：比色法 D－核糖：与浓盐酸和苔黑酚（甲基间苯二酚）共热产生绿色（670nm）。 D－2－脱氧核糖：与酸和二苯胺一同加热产生蓝紫色（595nm）。 二、核酸的超速离心 氯化铯 溴化乙锭密度梯度离心法 1、密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度 2、密度梯度超速离心测定DNA的G-C含量 3、密度梯度超速离心研究核酸的构象 RNA＞DNA；变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质 4、密度梯度超速离心纯化RNA或不同构象的DNA 超螺旋DNA或 三、核酸的凝胶电泳(gel electrophoresis) 1、基本原理：一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。 2、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 3、用途：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图、蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。 凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效果，分辨率高 4、琼脂糖电泳(agrose gel electrophoresis) ★以琼脂糖作为支持物 ★用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广 ★影响迁移率的因素： ①?核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 ②??凝胶浓度 ③?DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。 ④?电压，不大于5V/cm ★染色：0.5ug/ml EB ★