0103-司庆刚-产中性蛋白酶芽孢细菌的筛选-20102917.docVIP

产中性蛋白酶芽孢细菌的筛选 司庆刚 （山东农业大学，生命科学学院，2010级生物工程3班 ,泰安 ） 摘要：目的：豆豉中可以产生中性蛋白酶菌株，因此培养高产菌株，进行保藏，为进一步研究开发提供依据。方法：将豆豉样品进行预处理分离其中所产生的细菌，用酪蛋白平板法进行初步筛选活性较高的菌株，进行斜面菌种保藏。络蛋白平板上的菌落呈现圆形乳白色、光滑、边缘整齐、半透明的形态。结果：筛选出一株高产蛋白酶的菌株进行保藏。 关键词：蛋白酶、芽孢细菌、筛选 1.目的意义： 1.筛选获得一株高产中性蛋白酶的芽孢细菌菌株。 2.学习掌握从样品采集到菌种保藏的技术流程。 2.材料与方法： 1.1 材料 1.1.1 样品：农家豆豉 1.1.2 培养基：酪蛋白培养基、LB培养基、淀粉固体培养基、葡萄糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、马铃薯培养基、高氏一号培养基、蔗糖悬液、麸皮管、沙土管 1.1.3 实验仪器：恒温水浴锅、离心机、磁力搅拌器、分光光度计、带有紫外灯的超净工作台、恒温振荡器、普通光学显微镜、高压灭菌锅、电磁炉、微波炉、移液器、培养皿、5mL离心管、试管、搪瓷缸、接种环、玻璃棒、酒精灯、精密pH试纸 1.1.4 实验试剂：福林使用溶液、碳酸钠溶液（42.4g/L）、三氯乙酸（65.4g/L）、氢氧化钠溶液（20g/L）、盐酸溶液（1mol/L、0.1mol/L）、缓冲溶液（pH=7.5磷酸缓冲液）、酪蛋白溶液（10.0g/L）、L-酪氨酸标准储备溶液（100ug/L）、革兰氏染液、草氨酸结晶紫染液、卢戈氏碘液、5%孔雀绿染液、番红染液、95%乙醇甲基红指示剂、40%KOH、5%α-萘酚、无菌水、生理盐水等 1.2 方法 1.2.1 酪蛋白平板初筛[10]：取三份样品各5g，加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，80℃恒温水浴锅处理10min；将样品混合液进行梯度稀释到10 － 7，取10 － 3～ 10 － 7各0.1mL涂布于酪蛋白分离培养基平板上每个梯度三个板平行，37℃恒温培养48h；挑取蛋白水解圈h/d最大的三株菌于LB平板上划线纯化，每个菌种6个板，37℃恒温培养24h；取长势良好的单菌落斜面保藏，每个单菌落7支管，37℃培养至长满菌苔后于4℃冰箱中保存待用。 1.2.2 诱变育种：两瓶LB培养基中分别接入适量对应菌种，180rpm，37℃活化16h待用；离心收集（8000rpm，5min）活化好的菌种；倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。用无菌生理盐水悬浮菌液，配制成约1.0 ×108/ml：LB培养基，每株菌两支，置于37℃温度培养，待长满试管后转移至4℃保存。 2 数据与结果 2.1 初筛 初筛透明圈直径、菌落直径及其比值表 菌落直径（D/mm） 水解圈直径（H/mm） 比值(H/D) 6 23 3.83 8 23 2.88 15 16 1.07 10 27 2.70 16 27 1.69 根据上表的结果，选取1—3号菌株在LB平板三区划线分离纯化（3号菌株明显与其他菌株形态不同），每株6个平行，37°C培养24h。挑选长势良好的单菌落接于LB斜面上，37°C培养24h后放入4℃冰箱保存。 2.2 诱变育种 从初筛得到的1号菌株中，通过紫外线诱变，根据菌落大小跟水解蛋白透明圈大小比值，初步分离得到5株产中性蛋白酶活性较高的的芽孢细菌；2号菌株操作失败，未诱变成功。 结果如下 紫外诱变存活率与致死率 处理 1min 2min 3min 存活率/% 56.4% 0.09949% 致死率/% 43.6% 99.9% 根据实验结果，