18-2凝胶层析课件.ppt

2.样品的选择： 量适当, 粘度小。 3.洗脱液的选择： 每种样品分离所用的缓冲洗脱液应根据使样品稳定的原则使用。 七.应用 1.分离纯化 2.脱盐 3.测分子量 4.高分子溶液的浓缩 凝胶层析法分离蛋白质 [操作] 1. 装柱：在层析柱的底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的1/3时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的Sephadex G-50悬液，待底部凝胶沉积1~2cm时，再打开出口，凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约3cm即可。 3．层析 以基质为固定相(柱状或薄层状)， 以液体或气体为流动相， 有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用， 最终结果是使混合物得到分离。 4．操作容量 即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量； 一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。(mmol/g, mg/g, mmol/ml, mg/ml) 其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。 5．床体积(Vt) 通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。 Vt是基质的外水体积(V0)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和，即: Vt = V0+ Vi + Vg (详见图3-1) 6．洗脱体积(Ve) 洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。用Ve表示(见图3-7中OB)。 Ve = V0＋Kav(Ｖｉ＋Ｖｇ) 7．外水体积(V0) 外水体积指基质颗粒之间体积的总和。 8．内水体积(Vi) 内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。 9．基质体积(Vg) 基质体积是指基质自身所具有的体积。 V0、Vi 、 Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。 ＶＴ＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ 凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径较一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则可以在筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程度用分配系数 表示 洗脱体积； 外水体积； 凝胶床体积 在一定层析条件下， 和 均为固定值，而 随着被分离物分子量的变化而变化。组分分子量越大，则洗脱更容易（排阻越多）， 越小， 越小 各组分间的 值差异越大，分离效果越好； 差异越小,则分离效果很差，或根本无法分离 流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分 1、当Kav=0时，则Ve=Vo ，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分Ⅰ） 2、当Kav=1时，Ve=Vo+Vi 。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。Ve=Vo+Vi （图中组分Ⅲ） 3、当0＜Kav＜1时，Ve=Vo+ Kav（Vi ＋ Vg ）。表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，Ve即在Vo与Vo+Vi＋Vg之间变化（图中组分Ⅱ） 4、有时Kav＞1，表示凝胶对组分有吸附作用 （从内水中洗脱出来的含量下降），此时Ve＞Vo+Vi＋Vg。例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex G-25中的洗脱体积远超出理论计算的最大值 10．膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积用Vβ表示。即每克溶胀基质所具有的床体积。 Vβ = Vt / g 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。 三.凝胶层析的特点 （一）优点 ?1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结 ????构稳定,所以凝胶本身不与样品发生化 ????学反应。 2.凝胶层析的操作条件较温和,不易引起生 物物质的变性,即使用来分离一些理化性 质不稳定的物质也很少被破坏。 3.样品得率高,重复性好.如果按比例扩大柱 的体积和高度,可进行大量样品的分离纯 化。 （二）缺点 1.要求样品和洗脱液的粘度很低。 2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被 纯化的物质的分子量范围受到限制。 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用,如