专题三 核酸电泳技术课件.ppt

专题二 核酸电泳技术 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，它用于分离、鉴定和纯化DNA片段。该技术操作简单而迅速，并且能分离用其他方法如密度梯度离心等不能满意分离的DNA片段。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外线激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。 琼脂糖凝胶的分离范围很大。 50bp到百万bp长的DNA都可以在不同浓度和构型的琼脂糖凝胶中分离。小片段DNA(50～20 000bp)最适合在恒定强度和方向的电场中水平方位的琼脂糖凝胶内电泳分离。在这些条件下，DNA泳动速率通常随DNA片段长度的增加而减少，但与电场强度成正比。然而这一简明的相关性当DNA片段长度超过一个最大极限值时立即被破坏，这种情况主要是由于凝胶的构成和电场强度决定的。当线状双螺旋DNA的半径超过凝胶的孔径时就达到它分辨率的极限。此时，DNA不再被凝胶按其大小筛分，而必须以一端在前的方式在介质中迁移，就像通过曲折而又空间有限的管子。这种迁移模式称作“蠕行” 。 聚丙烯酰胺凝胶最适合分离小片段DNA(5—500bp)。它的分辨率非常强，长度上相差1bp或质量上相差0.1％的DNA都可以彼此分离。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比在制备和操作上还是更繁琐些。聚丙烯酰胺凝胶电泳是在恒定电场中垂直方位上进行的。 决定DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素 DNA分子的大小 双链DNA分子在凝胶基质迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移得越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。 琼脂糖浓度 给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移率的对数和凝胶浓度之间存在线状相关。 DNA的构象 超螺旋环状(I型)、切口环状(Ⅱ型)和线状(Ⅲ型)DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。上述三种类型的相对迁移率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，但是电流强度、缓冲液离子强度和I型超螺旋绞紧的程度或密度也影响相对迁移率。在一些条件下，I型DNA比Ⅲ型迁移得更快；在另一些条件下，顺序可能颠倒。绝大多数情况下，区分不同构象DNA的需求都很简单，主要是区分未处理的环状DNA样品和单一位点经限制酶作用线状化的同一DNA样品。 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。因此线状DNA-染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15％。 所用的电压 低电压下DNA片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子质量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kbDNA片段的良好分辨率，则所用电压不应高于5～8V／cm。 电泳缓冲液 DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子 (如用水替代电泳槽及凝胶中的缓冲液)则电导率降至很低，DNA不是全然不动，就是迁移极慢。高离子强度时，如错用了10×电泳缓冲液，电导率升高，即使应用适中的电压也会产生大量的热能。最严重时凝胶会熔化，DNA会变性。 琼脂糖凝胶电泳 材料 水平电泳槽及制胶模具 琼脂糖 电泳缓冲液 6×凝胶载样缓冲液 DNA样品 DNA大小标准品 溴化乙锭 / SYBRGold 紫外透射仪 琼脂糖 标准(高熔点)琼脂糖 制造它的原料是两种海藻，Gelidium和Gracilaria。这两种琼脂糖的凝点和熔点有所不同，但是在实际应用中每种来源的琼脂糖都可以用于分析或分离1-25kb范围的DNA片段。新类型的标准琼脂糖具有高凝胶强度和低电内渗(EEO)，可以灌制浓度低至0.3％的凝胶。这种凝胶用于电泳能方便地分离高分子质量DNA(直到60kb)。它在任何浓度下DNA迁移速度均比通用的标准琼脂糖快10％-20％。这一增加在百万碱基大小DNA的PFGE中将明显地节省时间。 低熔点／凝点琼脂糖 通过羟乙基化修饰的琼脂糖在较低的温度熔化，羟乙基化替代的程度决定准确的熔化和凝结温度。低熔点／凝点琼脂糖主要用于DNA的快速回收，因为大多数该类型琼脂糖在65℃熔化，这个温度远低于双链DNA的解链温度。这种特性使它还可以用于DNA的简单纯化和酶处理；在熔化的凝胶中用核酸直接进行细菌转化。化学修饰的琼脂糖比等浓度的标准琼脂糖有更高的筛分能力。该发现使琼脂糖的分辨力接近聚丙烯酰胺凝胶，因此可用于PCR产物、小片段DNA和小RNA(lkb)的分离。现在它能分辨少至4bp的DNA和分离200-800bp范围内相差2％的DNA片段。 电泳缓冲液 凝胶载样