实验三 酵母核酸的制备及成份鉴定课件.pptVIP

实验三 酵母核糖核酸的提取及组分鉴定 (先打开水浴锅,温度设置成100摄氏度) 一、目的 二、原理 三、器材 四、试剂和材料 五、操作 六、注意事项 一、目的 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法以 了解苔黑酚定量测定RNA的方法。 二、原理 酵母核糖核酸中RNA含量较多，RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，即得到RNA的粗制品。 核糖核酸中含有核糖、嘌呤碱，嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材 锥形瓶 大研钵 电子天平 离心机 恒温水浴锅 四、试剂和材料 酵母粉 0.04 M NaOH,95%乙醇,1.5 M H2SO4溶液,浓氨水,0.1M AgNO3 酸性乙醇溶液：30ml95%乙醇加0.3ml浓盐酸混匀。 苔黑酚--FeCl3溶液：将100 mg苔黑酚溶于100ml浓HCl中,再加入100mgFeCl3.6H2O，临用时配制。 定磷试剂： 按顺序以A：B：C：蒸馏水＝1：1：1：2（V/V）混匀,现配。A、17% H2SO4：　将17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中。B、2.5%（NH4）6Mo7O24：2.5g（NH4）4Mo2O7溶于100ml蒸馏水中。C、10%Vc：10g Vc溶于100ml蒸馏水中，用棕色瓶贮存。颜色呈淡黄色时可以使用，如呈深黄或棕色则失效。 五、操作 1、酵母RNA的提取(2-3人一份)将4g酵母溶于20ml0.04 M NaOH溶液中（先以少量 NaOH溶液湿润酵母，并充分研磨)， 将悬浮液转移到250ml锥形瓶中，在沸水浴30分钟，不时搅拌,冷却后转入离心管进行离心 . ----（蛋白质变性沉淀，RNA溶于碱性溶液） 离心10min（4000rpm),将上清液倾入10ml酸性乙醇溶液中，待核糖核酸沉淀完全后，离心3min（4000rpm），弃去上清。 --- RNA不溶于乙醇，pI=2.5） 用95%乙醇洗涤沉淀，离心3min（4000rpm）弃去上清液，共进行两次。 沉淀可在空气中干燥，即为酵母RNA的粗制品。 五、操作 2、RNA水解液的制备：取200mg 提取的核酸，加入1.5 M H2SO4 10ml ，在沸水浴中加热10分钟后制成水解液并进行组分的鉴定。 3、RNA组分的鉴定：① 嘌呤碱：取水解液1ml加入约1ml　0.1 M AgNO3溶液,然后加入过量的浓氨水，观察溶液的变化。② 核糖：取1支试管加入水解液1ml，加三氯化铁-盐酸溶液2 ml，再加苔黑酚溶液0.2ml，放沸水浴中10分钟，注意溶液颜色的变化。③ 磷酸：取1支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，在水浴中加热，观察溶液颜色的变化。 六、注意事项 1. 先以少量 NaOH溶液湿润酵母，并进行充分研磨，再用剩余的NaOH溶液冲洗研钵一起转入离心管。提取时,注意每个步骤的目的和意义 2.思考题：为什么提取率各组间会出现较大的差异 3.完成实验报告 * * 1.磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（Vc）存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。 2.嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。 3.戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。 脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。 注意仪器使用方法 离心管平衡!! (浓氨水\ FeCl3-浓HCl\定磷试剂在通风柜中)