第14章 色谱技术课件.pptVIP

1.色谱技术概述 1.1概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同，经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 1.2特点： （1） 纯化倍数高 （2） 操作规模小，放大困难 （3）?终产品纯化 （4） 适用于价格昂贵的产品 1.3色谱的分类 1.根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类 根据固定相的形状不同的分类： 3 根据流动相的物态不同的分类 ： 2.色谱分离的基本原理 2.1色谱分离的基本原理 （1）分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值 可由Langmuir方程得出 Kd---分配系数 q、c---溶质在固相和液相中的浓度 （2）阻滞因子Rf 定义：阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 意义：在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小 2.2色谱图及基本概念 （1）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱进入监测器，监测器的响应信号－时间（或流动相体积）曲线，称为色谱图或色谱流出曲线。 （2）基线：在操作条件下，色谱柱出口没有组分流出，仅有流动相流过监测器，此时流出的曲线。 （3）色谱峰：当样品中的组分随流动相流入监测器时，监测器的响应信号随时间变化所形成的峰形图形。 （4）峰形：对称于峰尖的正态分布曲线。 拖尾峰、前伸峰 （5）洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异 （6）保留值 保留值：混合物中各组分在色谱柱中停留的时间或将组分带出色谱柱所需流动相体积的数值 保留时间（tR）：从开始进样至柱出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。 死时间（t0）：不被固定相滞留的组分（空气等），从开始进样至出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。 校正保留时间（tR’） ：扣除死时间后的保留时间。 （tR’＝ tR- t0） 保留体积（VR） 、死体积（V0） 、校正保留体积（VR’） 相对保留值（r2，1）： 在相同操作条件下，待测组分与参比组分的校正保留值之比。 (7)分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰峰底宽度平均值之比。 （8）色谱柱的理论塔板：流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高（塔板高度） 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度 理论塔板高度：H L---柱长 4.色谱分离操作 （2）上样（吸附） （3）淋洗 （4）洗脱方法 离子交换色谱 凝胶过滤 吸附色谱 亲和色谱 分配色谱 疏水作用层析 （1）离子交换色谱 原理：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的缓冲液为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法。 常用的离子交换剂 葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 纤维素系列离子交换剂 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂 大孔性离子交换剂 离子交换柱层析操作 ①树脂的选择 ②树脂的预处理及转型 ③装柱及平衡（要保持均匀、无气泡和断层） 首先加入1/3h的起始缓冲液或水；其次加入树脂使树脂借助水的浮力缓慢自然沉降；最后用水或缓冲液平衡到所需要的条件，如特定pH、离子强度等。 ④上样：将溶解在少量溶剂中的试样加到柱上部 ⑤洗涤与洗脱：改变pH或离子强度 ⑥收集与检测 （2）凝胶过滤 在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离 ②优点： 操作简便 分离效果好，重复性高，回收率高 分离条件温和，不会使物质变性 凝胶不用再生，可反复使用 缺点：分离速度较慢、选择性低（仅分子量大小）、料液处理量少 ③分配系数 a.公式 b.大小－排阻程度（0－100%) Vt(床体积） ＝πr2h ＝外水体积（V0）+内水体积（Vi）+颗粒实际占有体积(Vg) (i)完全排阻组分 Kav＝0 Ve＝V0 （ii）部分排阻组分 Kav（0-1） （iii）完全进入胶孔组分 Kav＝1 Ve＝Vt ④凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶（sephadex） 由葡聚糖+环氧氯丙烷交联而成 sephadex G 10