第3章蛋白质的通性课件.pptVIP

第3章蛋白质的通性、纯化和表征 蛋白质的酸碱性质 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质分离纯化的方法 蛋白质相对分子质量的测定 蛋白质的含量测定与纯度鉴定 一、蛋白质的酸碱性质 1、 蛋白质的两性解离 ★蛋白质可解离基团有肽链末端α-氨基和α-羧基；侧链基团；如果是结合蛋白，辅基的可解离基团。主要是R基的基团解离。 ★蛋白质分子的可解离基团的pKa也可以通过酸碱滴定的方法来求得。 2、有机溶剂沉淀法： ★与水互溶的有机溶剂（极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等 ）能使蛋白质在水中的溶解度降低而沉淀析出。 ★有机溶剂能引起蛋白质沉淀主要原因是：加入有机溶剂会降低溶液的介电常数；溶质分子间的作用增加会使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，引起蛋白质脱去水化层。 ★用酒精沉淀蛋白质时低温快速沉淀的蛋白质不变性，属可逆沉淀，室温下用酒精沉淀蛋白质属不可逆沉淀。 3. 重金属盐沉淀法：当溶液的PH＞PI时，Pr颗粒带负电荷，它容易与重金属盐（氯化高汞、硝酸银、醋酸铅等）中的重金属离子（Hg2+、Cu2+、Ag2+）结合成不溶性盐而沉淀。 4. 生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、能沉淀蛋白质的生物碱，称为生物碱试剂以及某些酸（如：三氯乙酸、水杨酸和硝酸）也能沉淀蛋白质。 ５．蛋白质的相互沉淀作用 五、蛋白质分离纯化的一般原则 分离纯化蛋白质一般经过：前处理、粗分级分离和细分级分离。 1、前处理： 破碎生物组织； 选择合适的缓冲液把蛋白质提取出来； 如果所要的蛋白质主要集中在细胞的某一组分中，如细胞核、染色体、核糖体，则可用差速离心法进行分离。 2、粗分级分离：采用的方法有分段盐析法；等电点沉淀法和有机溶剂分级分离法等。 3、细分级分离：采用的方法一般有层析法；凝胶过滤法；离子交换层析法；吸附层析和亲和层析，必要时选择电泳法作进一步纯化。 利用对配体的特异生物学亲合力纯化——亲和层析 七、蛋白质相对分子质量的测定 凝胶过滤法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 沉降速度法 八、蛋白质的含量测定和纯度鉴定 蛋白质含量测定:凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（又叫Lowry)，紫外吸收法、染料结合法（考马斯亮蓝结合法，也叫Bradford法）和胶体金测定法等。 蛋白质纯度的鉴定:凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（又叫Lowry)，紫外吸收法、染料结合法（考马斯亮蓝结合法，也叫Bradford法）和胶体金测定法等。 * * Pr COOH NH3+ Pr COO- NH3+ Pr COO- NH2 +H+ +OH- +H+ +OH- 阴离子 pH＞pI 等电点 pH=pI 阳离子 pH＜pI ★蛋白质等电点定义，用pI 表示。 ★蛋白质在等电点时的特点 ★蛋白质的pI可在实验室测得，也与组成蛋白质的氨基酸种类有关。 2、蛋白质的等电点 一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质 蛋白质胶体溶液稳定的原因： 1）蛋白质颗粒大小：pr颗粒大小恰好适于形成胶体 2）带有电荷：在非pI的pH条件下，由于同种Pr颗粒表面带有相同电荷。 3）形成水化膜：由于Pr分子表面分布许多带电基团和极性基团，它们对水有高度亲和力，在水溶液中会把水分子吸附在分子的表面形成一层较厚的水化膜。 三、 蛋白质的沉淀反应 可逆性沉淀：沉淀的蛋白质，内部结构基本上没发生变化，仍保持原有生物学功能，消除沉淀或降低沉淀因素后蛋白质仍会溶解在原来的溶液中。 不可逆沉淀：沉淀出的蛋白质内部结构发生了变化，失去了生物学功能，消除沉淀因素后，不会溶解 盐析法：向Pr溶液加大量高浓度中性盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）能使蛋白质沉淀析出。蛋白质的分段盐析。 盐溶:在盐浓度很稀时,随着盐浓度的增高,球状蛋白质的溶解度增高。 三、 蛋白质的沉淀反应 三、 蛋白质的沉淀反应 反应名称 试 剂 颜色 反应有关基团 有此反应的Pr或aa 双缩脲反应 NaOH、CuSO2 紫红色 二个以上肽键 所有蛋白质 米伦反应 HgNO3、Hg(NO3)及HNO3、HNO2混合物 红色 ? Tyr 黄色反应 浓HNO3 黄色、橘色 ? Tyr、Phe 乙醛酸反应 乙醛酸试剂 沿管壁慢加浓H2SO4 两液层间出现紫色环 ? Trp （白明胶不含Trp） 坂口反应 Sakaguch反应) α-萘酚、NaClO 在NaOH溶液中 红色 胍基 Arg 酚试剂反应 碱性CuSO4、磷钨酸及鳞钼酸 蓝色 酚基、吲哚基 Tyr 茚三酮反应 茚三酮 蓝色 自由氨基及羧基 α-氨基酸 ? —OH N 四、 蛋白质的颜色反应 根据分子大小不同 透析和超