第二章 遗传的物质基础DNA2课件.pptVIP

第二章 　遗传的物质基础 一．遗传物质的发现 以四种碱基构成的脱氧核苷酸或核苷酸为基本单位通过3，5-磷酸二酯键连接成链状结构构成其一级结构 核酸的理化性质 DNA变性与复性 DNA芯片（基因芯片） DNA芯片（DNA chip）技术，实际上就是利用核酸杂交的原理，将不同序列的DNA片段（探针）印记到小玻片或相应介质上，然后将待检测DNA（带有标记）液与之孵育，经洗脱后，检测最终能够发生结合的DNA，从而判定待检测DNA序列的技术。 （二） 核酸测序 Sanger的酶学测序原理 Gilbert的化学测序法 自动测序仪的发明 DNA序列测定常用方法有如下3种： Maxam-Gilbert化学裂解法  化学裂解（直读，Sanger双脱氧末端法也是直读法）法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。 某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而使N-糖苷键断裂，暴露出的糖环以β-消除反应，在3’和5’位上断裂磷酸二酯键。使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。 化学裂解法测序的原理 1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端 2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列 表 特异断裂4种脱氧核苷酸的方法 Southern杂交分析示例 A. DNA体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D. Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中 1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。 Northern印迹杂交 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA 1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。 不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。 简便、迅速、应用广泛。 优点 类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。 用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。 使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。 3、DNA测序自动化 2、化学裂解法 1、末端终止法 测序过程（末端终止法）： DNA聚合酶复制DNA链，还包括DNA模板和单核苷酸A,C,T,G，还需要修饰过的所谓的“终止核苷酸”，每一种终止核苷酸的碱基被标记上不同的颜色的荧光染料； 在DNA复制过程中，由于加入了终止核苷酸，因此会产生不同长度的片段，而这些片段具有共同的起点，所以只有最后一个核苷酸有差异； 通过电泳将DNA片段按大小分离开，其结果将显示为由不同颜色组成的梯度； 由计算机解读每个色带，最后得出片段的碱基序列。 Leroy Hood Mike Hunkapiller Replicating a DNA strand in the presence of dideoxy-T An Automated sequencing gel: A Scan of one gel lane: We dont even have to read the sequence from the gel - the computer does that for us! 人神