双语班生物化学综合性实验..docVIP

生物化学综合性实验 实验一 动物组织基因组DNA的提取 实验二 琼脂糖凝胶电泳检测 实验一 动物组织基因组DNA的提取 一、实验目的 1．掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理； 2．熟悉从动物组织中提取DNA的操作技术； 3．从肌肉组织中提取到一定量的纯净的DNA样品。 二、实验原理 核酸和蛋白质是构成生物有机体的主要成分；核酸是生命的最基本物质。在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形成存在。核酸按其化学组成可以分成两大类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。 （一）DNA提取分为三个基本步骤： 1．细胞的破碎 首先要破碎经胞。方法有三种： ①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用SDS处理细胞，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞膜破裂。 2．核蛋白的提取 ①在酸性溶液中，DNA天然状态的DNA 是以DNA核蛋白形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNA核蛋白抽提出来，再把蛋白质除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 ②动物和植物组织的DNA核蛋白可溶于水或浓盐溶液，DNA核蛋白和RNA核蛋白在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNA核蛋白在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNA核蛋白在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。 将抽提得到的核蛋白用SDS（十二烷基磺酸钠）处理，DNA（或RNA）即与蛋白质分开。 3．沉淀去除蛋白质 常采用的去除蛋白的方法有3种： ①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。 ②用十二烷基磺酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。 ③用苯酚处理，然后离心分层，DNA 或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。（DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂） 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中很多的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分裂核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完成结构： ①化学因素，核酸的结构在pH值4.0-11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。 ②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。 ③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温（0℃左右）下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐（EDTA-Na）等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活，因此常获得较好的效果。 （二）酚/氯仿抽提DNA 此法运用十二烷基磺酸钠（SDS）和蛋白酶K，溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来，再加入苯酚和氯仿-异戊醇等有机溶剂，能使蛋白质变性，去除蛋白质、多糖、色素等，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。沉淀DNA溶于TE溶液中，即得总DNA溶液。 三、仪器、材料、试剂（一）仪器1．高速离心机2．烘箱3．冰箱4．水浴锅5．微量移液器6．高压灭菌锅（二）材料 酚/氯仿抽提法： 生理盐水、十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、75%乙醇、蛋白酶K、RNase酶、手术剪刀、镊子、吸水纸、微量取液器、研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔 试剂盒法： 即用型DNA抽提试剂盒 四