可用于基因功能研究的基因组学工具诱变..docVIP

8．可用于基因功能研究的基因组学工具——诱变 Alex和er S. Beliaev亚历山大?柏利耶夫 朱晨光译；魏华初校, 张晓君校对 8.1 引言 随着原核生物研究进入了后测序时代，人们需要用更多的实验方法来促进对细菌基因组的功能研究。时下，许多医学、环境和生物技术领域中重要的微生物研究由于缺乏足够的遗传学方法而受到了限制。尽管DNA芯片技术、用质谱法鉴定蛋白质等研究方法已经或正在被开发以满足此类研究，但这当中诱变法无疑是揭示基因功能的最有效手段之一。 了解一个复杂生物系统中的某个特殊基因的功能，是一个需要系统研究的多步骤的过程。最初，关于一个开放阅读框产物功能的信息可以根据生物信息学工具比较分析核苷酸序列来得到(详细讨论请看第三章)。然而并不是一个基因组中所有基因都可以用序列同源性预测其功能，而且，序列同源性并不自动对应相应的功能。不同基因之间存在复杂的进化和结构功能的关系，所以通过序列相似性推知基因功能这一方法会被误导甚至有时是错误的（Strauss 和 Falkow, 1997））））））λ噬菌体和μ噬菌体，尽管它们的结构和基因的组成比典型的转座子要复杂得多，但也被认为是TEs，并归为单独的一类（详见Thompson和Landy，1989；Pato，1989）））））））））））Judson 和 Mekalanos. 2000b））））））））））））））））））））））））））假结核耶尔森氏菌））））））））））π蛋白的转基因宿主菌中存在，不能在缺乏编码复制酶所必需的pir基因的菌株中复制。在大肠杆菌中，π蛋白能够通过带有一个拷贝pir基因的原噬菌体而获得。既然大多数的革兰氏阴性细菌不拥有pir基因，依赖 pir的R6K自杀载体可广泛用于基因置换突变（Kaniga 等, 1991; Skorupski 和 Taylor, 1996; Biswas 等, 1993; Kalogeraki 和 Winans, 1997; Alexeyev, 1999））））））））））’端形成融合，再接着就是带有另一个靶基因的截短拷贝的自杀载体整合到染色体上。当靶基因功能要求必需保留时，可以将一个完整的带有启动子的靶基因的5’端克隆进自杀性载体。在这个例子中，质粒整合将导致在靶基因和报告基因之间形成融合体，此时一个包含内生启动子序列的野生型等位基因是在插入位点的下游（Fig.8.6C）’末端能被用来构建一个反式的部分二倍体菌株，在这个菌株中一个完整的野生型基因拷贝位于载体序列的下游，报告基因盒和一个截短的靶基因拷贝位于这个野生型基因之后（Kalogeraki 和 Winans, 1997）））））））λ的重组功能替换（Murphy, 1998; Yu 等, 2000） λ的转化率为10-2，基因置换的频率大概是10-4到10-5重组子/存活体(Murphy 等., 2000)。这里描述的基因失活方法可以在一系列生物中产生稳定、容易选择的突变。利用PCR进行基因破坏的应用，在目标基因不必被克隆这方面比其它等位基因交换法有优越性。但一个主要的缺点是双交换重组的效率降低，需要筛选更大数量的突变体。此外，如果用于中断的基因中有一个转录终止子存在，也可能出现极性效应。 通过反向选择标记物构建无标记的缺失 用体外修饰了的等位基因替换原始基因构建无标记的突变细菌，是一种从分子尺度了解基因功能同时决定结构与功能之间关系的基本方法（Reyrat 等, 1998）。 因为将一个质粒的基因整合到染色体上的双交换事件是少见的，如果克隆的基因难以直接进行筛选的话，简化对此类事件的选择就不方便。在此种情况下，可用一个两步程序（图8.8）。首先，带有一个反向选择标记的质粒通过在同源基因之间发生一次单交换而被整合进染色体，在染色体上产生一个靶基因的副本。第二，染色体上的副本通过位于正向重复两侧之间的同源重组而被缺失，最后剩下染色体上的野生型拷贝或突变体拷贝。因为正向重复通常很短，所以期望的重组事件很少发生。质粒的抗标记物表型可用于直接选择质粒整合事件。一旦质粒被整合，就可通过检测质粒抗性标记的丢失来简化隔离子的筛选。然而，因为隔离子较少，经常需要一种选择染色体上整合的质粒发生丢失的方法。一种与整合质粒相对的选择方法是使用枯草芽胞杆菌sacB基因，该基因的表达对蔗糖敏感（Gay 等, 1983）。在有蔗糖的情况下，sacB基因的表达对革兰氏阴性菌是有毒的，这对选择质粒的丢失提供了一个直接方法。结果那些抗蔗糖的单菌落因为抗生素抗性的丢失和表现蔗糖拮抗而被筛选出来，抗蔗糖的表型是因为整合了的质粒丢失了造成的。如果靶基因两个拷贝之一有一个突变，一定数量的隔离子将丢失野生型序列，让突变留在染色体中。同源区域内突变发生的位置是决定保留突变等位基因的隔离子的百分率的重